Biyoaktif proteinler veya peptidler hidrojel Photochemistry biyolojik uygulamalarda kullanarak üzerinde desenlendirme
Summary
Bu yöntemde, photopolymerization kullanıyoruz ve polietilen glikol (PEG) hydrogels, sağlayan yüzeyinde protein veya peptid desen oluşturmak için tıklatın kimya teknikleri biyoaktif sinyaller hücresel yanıt vitro incelenmesi için immobilize .
Abstract
Hücre davranış ve kök hücre farklılaşması etkileyebilecek birçok biyolojik bir çekim gücü vardır. Genel hücre kültür yaklaşımlar içinde orta kontrol hücre davranış olarak çözünür faktörler güveniyor. Ancak, çözünür eklemeler belirli motifler içeren hikâyeler, matris bağlı büyüme faktörleri gibi sinyal, hücre-hücre sinyallemesi ve hücreleri üzerinde ortak etkiler vardır kayma biyokimyasal cues taklit edemez. Ayrıca, yüzey sertliği gibi Matrix biyofiziksel özellikleri geleneksel hücre kültürü çalışmalarının yöntemler kullanarak kolaylıkla yönetilebilir değil hücre kader, önemli rol oynarlar. Bu yöntemde, desenli biyoaktif proteinler sentetik polietilen glikol (PEG) hydrogels photochemistry kullanarak sağlamak için basit bir protokol tanımlayan. Bu platform yüzey sertliği ve kayma biyokimyasal cues bağımsız kontrol için sağlar. Bu hydrogels çok sayıda fizyolojik ilgili sertlik değerleri elde edebilirsiniz. Ayrıca, bu hydrogels yüzeylerin photopatterned biyoaktif peptidler ile olabilir veya proteinler thiol-KD ile kimya reaksiyonları tıklatın. Bu yöntemler protein işlevi sonra yüzey immobilizasyon korumak için optimize edilmiştir. Bu, herhangi bir protein veya peptid ilgi desenleri çeşitli oluşturmak için uygulanacak çok yönlü bir protokoldür. Son olarak, onlar dağınık şekilde belirli sinyallere yanıt olarak bu biyoaktif hydrogels yüzeyler numaralı seribaşı hücreler zamanla izlenebilir.
Introduction
Hücre davranışını etkiler birçok çekim gücü vardır. Genel olarak, tipik hücre kodlamayla teknikleri çözünür faktörler üzerinde hücresel yanıt temin için itimat; Ancak, bu yaklaşım için sınırlamalar vardır. Bu yöntemler yaygın bulunan tüm sinyal motifleri doğru görüntüleyemiyor içinde vivo. Böyle sinyal mekanizmaları münzevi büyüme faktörleri, hücre-hücre sinyallemesi ve dağınık şekilde özel biyokimyasal ipuçları içerir. Ayrıca, yüzey sertliği hücre davranış ve kök hücre farklılaşması içinde önemli bir rol oynayabilir ve kolaylıkla ortak hücre kodlamayla uygulamaları1,2kullanarak yönetilebilir değil. Biomaterial yaklaşımlar sinyal mekanizmaların keşfetmeye başlamak için yeni bir platform sunuyoruz. Özellikle, hydrogels yüzey sertliği3,4, immobilizing proteinler ve peptidler5,6, ayarlama ve dağınık şekilde belirli kalıpları7, oluşturmak için mükemmel aday olan 8.
Hydrogels doku Mühendisliği hücre dışı Matriks (ECM)9,10ile onların biyofiziksel ve biyokimyasal ortak nedeniyle iskele olarak yaygın olarak kullanılır. Biyouyumlu ve vücudun birçok dokularda bulunan doğal polimerler için iskele, ortak seçenekleri bulunmaktadır. Doğal polimerler yüzeyler kullanma sınırlaması onlar bioconjugation için kolay elde edilebilir kimyasal moieties olmaması. Öte yandan, sentetik hydrogels, bu nedenle PEG, hedeflenen kimyaları11,12mükemmel platformlar şunlardır. Ayrıca, PEG hydrogels hücresel yanıt temin değil ve bu nedenle inert omurgalarına biyoaktif iskele oluşturmak için kullanılır.
Biyoaktif hydrogels oluşturmak için kimya reaksiyonları istihdam edilmektedir photopolymerization ve thiol-KD’ı tıklatın. Bu photoreactions bir photoinitiator ve UV ışık kaynağı gerektirir. Photoinitiators UV ışığına tanıttığında, formu radikaller koparamaz. Tezler radikaller reaksiyonu başlatmak için gerekli olan ancak protein bioactivity12,13olumsuz yönde etkileyebilir. Bu nedenle, photoinitiator ve UV pozlama süreleri protein bioactivity korumak için en iyi duruma getirmek çok önemlidir.
Bu yöntemde, hydrogels akrilat akrilat zinciri büyüme photopolymerization sentezlenmiş. PEG-diacrylate (PEGDA) monomerleri dallı polimer ağlar hidrojel yapısı için sorumlu oluşturmak için birbirleri ile tepki. PEGDA monomerleri jel öncü çözüm içindeki konsantrasyonu substrat sertlik kontrol edecek. Hidrojel boyutu nedeniyle küçük gözenek, ECM proteinler fibronektin gibi kolayca hidrojel hücre eki amacıyla içinde dahil edilebilir. Son olarak, bu hydrogels yüzey ile biyoaktif peptidler desenli olabilir veya proteinler thiol-KD ile kimya reaksiyonları tıklatın. Burada, unreacted ücretsiz İnceltilebilen hidrojel sistemi içinde protein veya UV ışığına maruz kaldığında peptid bulunan ücretsiz thiols ile tepki olacaktır. Proteinler veya peptidler hidrojel yüzeyinde immobilize sonra hidrojel 4 ° C’de birkaç hafta için bioactivity kaybetmeden depolanabilir. Bu kolaylık, esnek deneysel planlama ve labs arasında işbirliği imkanı sunmaktadır. Genel olarak, bu platform biyomekanik ve mekansal biyokimyasal kontrol, bağımsız birbirlerinin hücresel davranışlarını etkilemek belgili tanımlık fırsat sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı biyolojik uygulamalar için biyoaktif protein desen oluşturmak için bir yöntem sağlar. Bu iletişim kuralı farklı deneyler için adapte yapılan birçok değişikliği vardır. İlk olarak, hücre ek gereksinimleri için farklı hücre türleri değişir. Zavallı hücre eki jeller için başlangıçta gözlem yapılırsa, öncü çözüm içindeki ECM protein konsantrasyonu artan tavsiye edilir. Diğer ECM protein kollajen, laminin veya bunların bir arada farklı türleri dahil olmak üzere f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada özellikle Amerikan Kalp Derneği bilim adamı kalkınma hibe gelen hibe tarafından desteklenmiştir (G.D. 12SDG12050083), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21HL102773, R01HL118245 G.D. için) ve Ulusal Bilim Vakfı (CBET-1263455 ve G.D. CBET-1350240).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
Referências
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/…/MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017)
- Ellman’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017)
- Desalting Columns. GE Life Sciences Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017)
