זיהוי ואפיון הגורמים גרורתי על ידי העברה גנטית לתוך הרומן RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם מאתר
Summary
אנו מציגים פרוטוקול להפגין מערכת העברת גנים סומאטית הרומן ניצול RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם העכבר כדי ללמוד את הפונקציה של גנים גרורות. העופות רטרווירוסים נמסרות intracardiacally כדי להבטיח העברה גנטית לתוך נגעים טרום ממאירים, לא פולשנית של תאי β בלבלב בעכברים בוגרים.
Abstract
סרטן גרורתי חשבונות עבור 90% ממקרי המוות בחולים עם גידולים מוצקים. יש צורך דחוף כדי להבין טוב יותר את מנהלי ההתקנים של גרורות סרטן וכדי לזהות מטרות טיפולית הרומן. כדי לחקור את האירועים המולקולריים להסיע את ההתקדמות של סרטן ראשוני גרורות, פיתחנו מודל העכבר bitransgenic, RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף. במודל זה העכבר, יחצ ן אינסולין עכברוש (RIP) כונני הביטוי של SV40 T אנטיגן (תג) ושל הקולטן עבור קבוצת משנה של וירוס leukosis העופות (מס ערך מוסף) בתאי β בלבלב. העכברים לפתח גידולים נוירואנדוקריניים הלבלב עם 100% penetrance דרך שלבים מוגדרים היטב דומים tumorigenesis האנושי, עם שלבים לרבות היפרפלזיה, אנגיוגנזה, אדנומה קרצינומה פולשנית. כי RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים אינם מפתחים מחלה גרורתית, שינויים גנטיים המקדמים גרורות ניתן לזהות בקלות. ג’ין סומאטית להעביר לתוך לבטא-מס ערך מוסף, מתרבים β בלבלב נגעים premalignant מושגת באמצעות הזרקת intracardiac של רטרווירוסים העופות מסתירים את שינוי גנטי הרצוי. כייל של > עונה 1 פרק 108 יחידות זיהומיות לכל מ”ל נחשבת מתאימה ויוו זיהום. בנוסף, רטרווירוסים העופות יכולים להדביק שורות תאים שמקורם גידולים RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים עם יעילות גבוהה. הקווים התא יכול לשמש גם כדי לאפיין את הגורמים גרורתי. כאן אנחנו מדגימים כיצד לנצל את מודל זה העכבר וסלולרי קווים כדי להעריך את הפונקציות של המועמד גנים גרורות הגידול.
Introduction
סרטן ביותר נובעים מוטציות סומאטית 1. מודלים קונבנציונאלי העכבר מהונדסים גנטית (GEMM) סיפקו תובנות משמעותיות התרומה של שינויים גנטיים הספציפיים ל- tumorigenesis 2. עם זאת, יש להם מספר מגבלות. החיסרון העיקרי של מודלים אלה היא כי הם אינם משתכפלים הטבע סדיר של היווצרות סרטן בבני אדם, שבו כמה תאים בתוך רקמה לרכוש שינויים גנטיים. מוטציות בעכברים מהונדס, נוק אאוט הינם גם germline עם פוטנציאל להשפיע על התפתחות. יתר על כן, יצירת מודלים אלה העכבר הוא יקר וצורך.
גרורה היא נושא משמעותי בשטח מסרטן. מידול גרורות כבר קשה ב- GEMM. גרורות ספונטנית נדיר העכבר. Penetrance הוא משתנה והוא השהיית זמן רב ב GEMM של גרורות 3. מודלים ניסיוניים גרורות מעסיקים הזרקה ישירה של תאים למחזור של עכברים, כך בשלבים המוקדמים המפל גרורתי מסולקות.
כדי להתגבר על חלק מהמגבלות הנ ל לימוד גורמים גרורתי במודלים של העכבר, פיתחנו מודל העכבר bitransgenic, RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף4. האסטרטגיה מבוססת על שילוב השימוש של מודל העכבר התקדמות הגידול מאוד-מסונכרנות, RIP-תג 5, ושל הקולטן leukosis העופות קבוצת משנה של וירוס, מס ערך מוסף 6,7. RIP-תג זה; RIP-מס ערך מוסףדגם העכבר מאפשר גנים להיות מוחדרים תחושתיים זן העכבר bitransgenic יחיד. עם אנטיגן SV40 T לדכא את הפונקציות מדכא הגידול של Rb ו- p53, עכברים לפתח גידולים נוירואנדוקריניים הלבלב באופן דומה כדי tumorigenesis האנושי, עם שלבים לרבות היפרפלזיה, אנגיוגנזה, אדנומה קרצינומה פולשנית. מודל RIP-תג זה היה מאלף מאוד להבנת ההיכר של סרטן, לא מוגבל הלבלב גידולים נוירואנדוקריניים. זה שימש גם ניסויים פרה 8.
אנו מציגים פרוטוקול להעברת הגן סומאטית באמצעות הזרקה של רטרווירוסים העופות intracardiacally לתוך RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים. זיהום מוצלח עם RCASBP-derived רטרווירוסים העופות מחייב באופן פעיל מתרבים בתאי המטרה. לכן, בחרנו RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים בגיל שבעה שבועות של גיל, כאשר היפרפלזיה מתפתח אצל כ-50% באיי לנגרהנס. הזרקת intracardiac חדרית השמאלי של וירוסים כייל נוגדנים גבוה נדרשת כדי להשיג יעילות זיהום של 10-20% 4. שיטת העברה זו מפחיתה את דילול משמעותי של נגיפים בתוך מחזור הדם לפני וירוסים מגיעים לנגרהנס.
באמצעות גישה זו, בעבר הראו כי Bcl-xL מקדמת גרורות סרטן עצמאית של 4,שלה פונקציית anti-מוות9. הפונקציה גרורתי אנטי-מוות-עצמאית לא נצפתה כאשר Bcl-xL בא לידי ביטוי דרך transgene בכל תאי β בלבלב ברחבי ontogeny tumorigenic ב RIP-התג; RIP-Bcl-xL העכבר מודל 10. לפיכך, המודל העכבר שלנו מציע הזדמנות ייחודית כדי לזהות ולאפיין פונקציות של את הגנים כשאני לידי ביטוי בשלב מאוחר יותר של tumorigenesis. בגלל 2-4% של איים להתפתח גידולים RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף bitransgenic עכברים ללא זיהום נגיפי, לא כל נגעים premalignant נגועים רטרווירוסים העופות נגזר RCASBP, ניתן לזהות רק את הגורמים מעניקה יתרון בררני במהלך הטבעי של tumorigenesis. בפרט, גורמים גרורתי בקלות הרבה ביותר תוכר על ידי שיטה זו, כי הלבלב בלוטות הלימפה או לאיברים אחרים גרורה אינה מתרחשת בדרך כלל ב- RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, אנו המתואר מודל העכבר רב עוצמה, RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף, כדי להשיג את המסירה הגן סומאטית ויה רטרווירוסים העופות עבור זיהוי ואפיון הגורמים גרורתי. למרות RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף עכברים לפתח גידולים נוירואנדוקריניים הלבלב, גורמים גרורתי מזוהה במודל עכבר זה עשויה גם לקדם גרורה של …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים הרולד Varmus בריאן ק. לואיס, דאגלס Hanahan, דני הואנג, שרון פנג, מייגן וונג, Manasi מ Godbole. Y.C.N.D. נתמך על ידי משרד ההגנה גרנט W81XWH-16-1-0619 NIH גראנט 1R01CA204916.
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
Referências
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
