Определение и характеристика метастатическим факторов путем переноса генов в романе RIP-тег; РИП tva мышиных модель
Summary
Мы представляем протокол продемонстрировать Роман соматическая генная система передачи, используя RIP-тегов; RIP-tva мыши модель для изучения функции генов в метастазов. Птичий ретровирусы поставляются intracardiacally обеспечить перенос генов в предварительно злокачественных, неинвазивный поражения поджелудочной железы β-клеток у взрослых мышей.
Abstract
Метастатического рака составляет 90% случаев смерти среди больных с солидными опухолями. Существует настоятельная необходимость лучше понять водителей метастазов рака и для выявления роман терапевтических целей. Расследовать молекулярные события, которые управляют прогрессии от первичного рака метастазы, мы разработали модель bitransgenic мыши, RIP-тегов; РИП tva. В этой модели мыши крысы инсулина промоутер (RIP) диски выражение антигена SV40 T (тег) и рецепторов для подгруппы вирус птичьего лейкоза (НДС) в клетках поджелудочной железы β. Мышей развивать нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы с 100% пенетрантностью через четко определенные этапы, которые похожи на человека tumorigenesis, с этапов, включая гиперплазии, ангиогенез, аденома и инвазивной карциномы. Потому что RIP-тега; RIP-tva мышей не развиваются метастатической болезни, генетические изменения, способствующие метастазы могут быть определены легко. Соматическая генная передача в tva выражая, размножающихся поджелудочной железы β предраковых поражений достигается через внутрисердечной инъекции птичьего ретровирусы, укрывательство желаемого генетические изменения. Титр > 1 x 108 инфекционных единиц / мл считается подходящим для инфекции в естественных условиях . Кроме того птичьего ретровирусы могут заразить клеточных линий, полученных от опухоли в RIP-тегов; RIP-tva мышей с высокой эффективностью. Линии клетки также может использоваться для характеристики метастатического факторов. Здесь мы показано, как использовать эту модель мыши и клеточной линии для оценки функции генов кандидата в метастазов опухоли.
Introduction
Большинство раковых заболеваний возникают от соматических перегласовок 1. Обычные генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) оказали значительное понимание вклада конкретных генетических изменений к tumorigenesis 2. Однако они имеют некоторые ограничения. Основным недостатком этих моделей является, что они не повторить спорадический характер образования опухоли в организме человека, в которых только некоторые клетки внутри ткани приобретают генетические изменения. Мутации в нокаут и трансгенных мышей также являются микрофлорой потенциально могут повлиять на развитие. Кроме того создание этих моделей мыши является дорогостоящим и трудоемким.
Метастазирование является важным вопросом в области рака. Моделирование метастазирование был трудным в ГЭММ. Спонтанное метастазов редок в мыши. Пенетрантностью является переменной и задержка в ГЭММ метастазированием 3. Экспериментальный метастазов модели используют прямой инъекции клеток в оборот мышей, поэтому первые шаги в метастатических Каскад удаляются.
Чтобы преодолеть некоторые из вышеуказанных ограничений в изучении метастатического факторов в модели мыши, мы разработали модель bitransgenic мыши, RIP-тегов; РИП tva4. Стратегия основана на комбинированное использование модель мыши прогрессии опухоли весьма синхронизированы, RIP-тег 5, и рецептора для подгруппы A птичьего лейкоза вирус, tva 6,7. Этот RIP-тег; RIP-tvaмодель мыши позволяет гены соматически вносимых в единый bitransgenic мыши штамм. С антигеном SV40 T, подавления опухоли подавляющие функции Rb и p53 мышей развивать нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы в Аналогичным образом человека tumorigenesis, с этапов, включая гиперплазии, ангиогенез, аденома и инвазивной карциномы. Эта модель RIP-тег был весьма поучительна для понимания отличительными признаками рака, не ограничиваясь нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы. Он также был использован в доклинических испытаний 8.
Мы представляем протокол для передачи соматическая генная через инъекции птичьего ретровирусы intracardiacally в RIP-тегов; RIP-tva мышей. Успешное инфекции с RCASBP-производные птичьего ретровирусы требует активно пролиферирующих клеток-мишеней. Поэтому мы выбрали RIP-тегов; RIP-tva мышей в 7 недель возраста, когда в около 50% панкреатических островков развивается гиперплазия. Для достижения эффективности 10-20% 4инфекции требуется левого желудочка внутрисердечной инъекции высокий титр вирусов. Этот способ доставки уменьшает значительное разбавление вирусных частиц в циркуляции вирусов до панкреатических островков.
Используя этот подход, мы ранее продемонстрировали, что Bcl-xL способствует метастазов рака, независимо от его анти apoptotic функция 4,9. Эта функция анти apoptotic независимые метастатическим не наблюдалось, когда Bcl-xL была выражена через трансген во всех клетках поджелудочной железы β всей онкогенной Онтогенез в RIP-тегов; RIP-Bcl-xL мыши модель 10. Таким образом наша модель мыши предлагает уникальную возможность для определения и описания функций генов когда выражена на более позднем этапе tumorigenesis. Потому что 2-4% островков развиться в опухоли в RIP-тегов; RIP-tva bitransgenic мышей без вирусной инфекции и не все предраковых поражений заражены RCASBP-производные птичьего ретровирусы, могут быть определены только те факторы, которые возлагают селективное преимущество над естественный ход развития опухолей. В частности метастатические факторов будет легче всего признана этим методом, потому что метастазы поджелудочной железы лимфатические узлы или другие органы обычно не происходит в RIP-тегов; RIP-tva мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы описали модель мощный мыши, RIP-тегов; RIP-tva, для достижения соматическая генная доставки через птичьего ретровирусы для идентификации и определения характеристик метастатического факторов. Хотя RIP-тега; RIP-tva мышей развивать нейроэндокринных опухолях под?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Гарольд Varmus, Брайан C. Льюис, Дуглас Hanahan, Дэнни Huang, Шарон Панг, Меган Вонг и Манаси м. Godbole. Y.C.N.D. поддерживается DOD Грант W81XWH-16-1-0619 и Грант 1R01CA204916 низ.
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
Referências
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
