同定と新規リップ-タグ; に遺伝子導入による転移因子の解析RIP tvaマウスモデル
Summary
リップ-タグを利用した体細胞遺伝子の転送システムを実証するためのプロトコルを提案します。RIP tvaマウス モデル転移遺伝子の機能を研究します。鳥のレトロ ウイルスは、成体マウスの膵 β 細胞の前癌性、非侵襲的病変への遺伝子導入を確保するため intracardiacally が配信されます。
Abstract
転移がんは、固形腫瘍患者の死亡の 90% を占めています。がん転移のドライバーを理解して新たな治療標的を識別するために緊急の必要性があります。転移する癌から進行を駆動する分子のイベントを調査して、bitransgenic マウス モデル、リップ-タグを開発します。RIP tva。このマウス モデルでラットのインスリン プロモーター (RIP) は、膵 β 細胞における SV40 T 抗原 (タグ) およびサブグループ (tva) トリ白血病ウイルスの受容体の発現を駆動します。マウスは、過形成、血管新生、腺腫、浸潤癌などの段階で人間の腫瘍に類似している明確に定義された段階で 100% の浸透度を持った膵神経内分泌腫瘍を開発します。リップ-タグ;RIP tvaマウスは、転移性疾患を発症しない、転移を促進する遺伝の変化を簡単に識別することができます。体細胞遺伝子の tva 表現に、前癌病変は膵 β を増殖目的遺伝子変異をかくまっている鳥でレトロ ウイルスの心腔内注射によって実現されます。力価 > 1 x 108感染単位 ml は生体内で感染症の適切なと見なされます。さらに、鳥のレトロ ウイルスリップ-タグで腫瘍由来細胞株に感染します。RIP tva高効率を持つマウス。細胞は、転移性の要因を明らかにも使用できます。ここで我々 はこのマウス モデルを利用し細胞の腫瘍の転移で候補者の遺伝子の機能を評価する方法を示します。
Introduction
ほとんどの癌は、体細胞変異1から発生します。従来の遺伝子組み換えマウス モデル (ジェム) は、腫瘍2に特定の遺伝子変異の貢献に重要な洞察力を提供しています。ただし、彼らはいくつかの制限があります。これらのモデルの主な欠点は、組織内の一部のセルだけが遺伝の変化を取得する人間の腫瘍の形成の散発的性質を複製しないこと。トランスジェニック、ノックアウト マウスの突然変異生殖開発に影響を与える可能性があります。また、これらマウス モデルの生成は高価で時間がかかるです。
転移は、がんの分野で重要な問題です。転移のモデリングはジェムで難しくなっています。自然転移は、マウスではまれです。浸透度は可変して転移3のジェムで長い待ち時間です。転移の翼列の初期の手順が排除されますので、実験的転移モデルはマウスの循環にセルの直接注入を採用しています。
Bitransgenic マウス モデル、リップ-タグ マウス モデルにおける転移因子を勉強の上記の制限の一部を克服するために開発しました。RIP tva4。戦略は、高い同期腫瘍進行マウス モデル、 RIP タグ5、および受容体サブグループ A トリ白血病ウイルス、tva 6、7の使用を組み合わせることに基づいています。このリップ-タグ;RIP tvaマウス モデルにより、単一の bitransgenic マウス緊張体細胞染色体導入する遺伝子。SV40 T 抗原 p53 および Rb の腫瘍抑制機能を抑制、マウスは過形成、血管新生、腺腫、浸潤癌などの段階で人間の腫瘍と同様の方法で膵神経内分泌腫瘍を開発します。このRIP タグモデルは、がん、膵神経内分泌腫瘍に限定されないの認刻極印の私達の理解に非常に有益されています。また、前臨床試験8で使用されています。
体細胞遺伝子伝リップ-タグに鳥レトロ ウイルス intracardiacally の注入のためのプロトコルを提案します。RIP tvaマウス。RCASBP 由来鳥レトロ ウイルスを感染ターゲットの積極的に増殖の細胞が必要です。したがって、我々 はリップ-タグを選んだRIP tva 7 週齢、膵島の約 50% に過形成を開発するときにマウス。高力価ウイルスの左心室心腔内注射は、10-20 4の感染効率を達成するために必要です。この配信方法は、ウイルス膵島に到達する前に循環内のウイルスの粒子の重要な希釈を低減します。
このアプローチを使用すると、以前 Bcl-xl がその抗アポトーシス機能4,9の独立したがんの転移を促進することを確認しました。Bcl xLリップ-タグに発癌性個体中すべての膵 β 細胞での遺伝子を介して発現していたときこの抗アポトーシス独立転移機能は観察されなかったRIP Bcl xLモデル10をマウスします。したがって、マウス モデルは、ユニークな機会を識別し、特徴付ける腫瘍形成の後の段階で表現される場合に遺伝子の機能を提供しています。小島の 2-4%リップ-タグで腫瘍に発展するのでRIP tvaウイルス感染とすべての前癌病変なし bitransgenic マウスは、RCASBP 由来の鳥のレトロ ウイルスに感染している、癌の自然経過の選択的優位性を与える要因のみを識別できます。特に、転移要因最も簡単に認識されますこのメソッドによって膵リンパ節や他の臓器への転移はリップ-タグで通常発生しませんのでRIP tvaマウス。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究ではマウスの強力なモデル、リップ-タグについて述べるRIP-tva鳥レトロ ウイルスの同定と転移の要因の解析を介して体細胞遺伝子配達を達成するために。ただし、リップ-タグ;RIP tvaマウス膵神経内分泌腫瘍を発症、このマウス モデルにおける転移因子も他の種類のがんの転移を促進するかもしれません。
我々 のアプローチの導入したがって散発的な…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ハロルドバーマス、ブライアン c. ルイス、腫瘍形成の各、ダニー黄、シャロン パン、ミーガン ・ ウォン、Manasi m. Godbole を感謝いたします。Y.C.N.D. をサポートするには、DOD グラント W81XWH-16-1-0619 と NIH グラント 1R01CA204916。
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
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