Мы представляем протокол продемонстрировать Роман соматическая генная система передачи, используя RIP-тегов; RIP-tva мыши модель для изучения функции генов в метастазов. Птичий ретровирусы поставляются intracardiacally обеспечить перенос генов в предварительно злокачественных, неинвазивный поражения поджелудочной железы β-клеток у взрослых мышей.
Метастатического рака составляет 90% случаев смерти среди больных с солидными опухолями. Существует настоятельная необходимость лучше понять водителей метастазов рака и для выявления роман терапевтических целей. Расследовать молекулярные события, которые управляют прогрессии от первичного рака метастазы, мы разработали модель bitransgenic мыши, RIP-тегов; РИП tva. В этой модели мыши крысы инсулина промоутер (RIP) диски выражение антигена SV40 T (тег) и рецепторов для подгруппы вирус птичьего лейкоза (НДС) в клетках поджелудочной железы β. Мышей развивать нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы с 100% пенетрантностью через четко определенные этапы, которые похожи на человека tumorigenesis, с этапов, включая гиперплазии, ангиогенез, аденома и инвазивной карциномы. Потому что RIP-тега; RIP-tva мышей не развиваются метастатической болезни, генетические изменения, способствующие метастазы могут быть определены легко. Соматическая генная передача в tva выражая, размножающихся поджелудочной железы β предраковых поражений достигается через внутрисердечной инъекции птичьего ретровирусы, укрывательство желаемого генетические изменения. Титр > 1 x 108 инфекционных единиц / мл считается подходящим для инфекции в естественных условиях . Кроме того птичьего ретровирусы могут заразить клеточных линий, полученных от опухоли в RIP-тегов; RIP-tva мышей с высокой эффективностью. Линии клетки также может использоваться для характеристики метастатического факторов. Здесь мы показано, как использовать эту модель мыши и клеточной линии для оценки функции генов кандидата в метастазов опухоли.
Большинство раковых заболеваний возникают от соматических перегласовок 1. Обычные генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) оказали значительное понимание вклада конкретных генетических изменений к tumorigenesis 2. Однако они имеют некоторые ограничения. Основным недостатком этих моделей является, что они не повторить спорадический характер образования опухоли в организме человека, в которых только некоторые клетки внутри ткани приобретают генетические изменения. Мутации в нокаут и трансгенных мышей также являются микрофлорой потенциально могут повлиять на развитие. Кроме того создание этих моделей мыши является дорогостоящим и трудоемким.
Метастазирование является важным вопросом в области рака. Моделирование метастазирование был трудным в ГЭММ. Спонтанное метастазов редок в мыши. Пенетрантностью является переменной и задержка в ГЭММ метастазированием 3. Экспериментальный метастазов модели используют прямой инъекции клеток в оборот мышей, поэтому первые шаги в метастатических Каскад удаляются.
Чтобы преодолеть некоторые из вышеуказанных ограничений в изучении метастатического факторов в модели мыши, мы разработали модель bitransgenic мыши, RIP-тегов; РИП tva4. Стратегия основана на комбинированное использование модель мыши прогрессии опухоли весьма синхронизированы, RIP-тег 5, и рецептора для подгруппы A птичьего лейкоза вирус, tva 6,7. Этот RIP-тег; RIP-tvaмодель мыши позволяет гены соматически вносимых в единый bitransgenic мыши штамм. С антигеном SV40 T, подавления опухоли подавляющие функции Rb и p53 мышей развивать нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы в Аналогичным образом человека tumorigenesis, с этапов, включая гиперплазии, ангиогенез, аденома и инвазивной карциномы. Эта модель RIP-тег был весьма поучительна для понимания отличительными признаками рака, не ограничиваясь нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы. Он также был использован в доклинических испытаний 8.
Мы представляем протокол для передачи соматическая генная через инъекции птичьего ретровирусы intracardiacally в RIP-тегов; RIP-tva мышей. Успешное инфекции с RCASBP-производные птичьего ретровирусы требует активно пролиферирующих клеток-мишеней. Поэтому мы выбрали RIP-тегов; RIP-tva мышей в 7 недель возраста, когда в около 50% панкреатических островков развивается гиперплазия. Для достижения эффективности 10-20% 4инфекции требуется левого желудочка внутрисердечной инъекции высокий титр вирусов. Этот способ доставки уменьшает значительное разбавление вирусных частиц в циркуляции вирусов до панкреатических островков.
Используя этот подход, мы ранее продемонстрировали, что Bcl-xL способствует метастазов рака, независимо от его анти apoptotic функция 4,9. Эта функция анти apoptotic независимые метастатическим не наблюдалось, когда Bcl-xL была выражена через трансген во всех клетках поджелудочной железы β всей онкогенной Онтогенез в RIP-тегов; RIP-Bcl-xL мыши модель 10. Таким образом наша модель мыши предлагает уникальную возможность для определения и описания функций генов когда выражена на более позднем этапе tumorigenesis. Потому что 2-4% островков развиться в опухоли в RIP-тегов; RIP-tva bitransgenic мышей без вирусной инфекции и не все предраковых поражений заражены RCASBP-производные птичьего ретровирусы, могут быть определены только те факторы, которые возлагают селективное преимущество над естественный ход развития опухолей. В частности метастатические факторов будет легче всего признана этим методом, потому что метастазы поджелудочной железы лимфатические узлы или другие органы обычно не происходит в RIP-тегов; RIP-tva мышей.
В этом исследовании мы описали модель мощный мыши, RIP-тегов; RIP-tva, для достижения соматическая генная доставки через птичьего ретровирусы для идентификации и определения характеристик метастатического факторов. Хотя RIP-тега; RIP-tva мышей развивать нейроэндокринных опухолях под?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Гарольд Varmus, Брайан C. Льюис, Дуглас Hanahan, Дэнни Huang, Шарон Панг, Меган Вонг и Манаси м. Godbole. Y.C.N.D. поддерживается DOD Грант W81XWH-16-1-0619 и Грант 1R01CA204916 низ.
RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
DMEM | Corning | 10-013-CV | |
fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
Superfect | Qiagen | 301305 | |
Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
Insulin Syringes | BD | 329461 | |
synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |