Vi presenterer en protokoll for å demonstrere en roman somatiske genet overføring system bruker RIP-Tag; RIP-LiveTV musemodell å studere funksjonen av gener i metastasering. De avian retroviruses leveres intracardiacally for å sikre genoverføring til pre-ondartet, noninvasive lesjoner av bukspyttkjertelen β celler i voksen mus.
Metastatisk kreft står for 90% av dødsfall hos pasienter med solide svulster. Det er et presserende behov for å forstå driverne for kreft metastasering og identifisere romanen terapeutiske mål. Undersøke molekylære hendelser som driver utviklingen av primære kreft til metastasering, har vi utviklet en bitransgenic musemodell, RIP-Tag; RIP-LiveTV. I denne musen modellen stasjoner rat insulin arrangøren (RIP) uttrykk for SV40 T antigen (Tag) og reseptoren for undergruppe avian leukosis virus (tva) i bukspyttkjertelen β celler. Mus utvikle bukspyttkjertelen neuroendocrine svulster med 100% penetrance gjennom veldefinerte faser som ligner menneskelige tumorigenesis, med etapper inkludert hyperplasi, angiogenese, adenom og invasiv carcinoma. Fordi RIP-Tag; RIP-LiveTV mus ikke utvikle metastatisk sykdom, genetiske endringer som fremmer metastasering kan identifiseres enkelt. Somatiske genet overføre til tva-uttrykke, voksende bukspyttkjertelen β premalignant lesjoner oppnås gjennom intracardiac injeksjon av avian retroviruses skjuler ønsket genetisk endring. En titer av > 1 x 108 smittsomme enheter per ml anses hensiktsmessig for i vivo infeksjon. I tillegg kan avian retroviruses infisere cellelinjer avledet fra svulster i RIP-Tag; RIP-LiveTV mus med høy effektivitet. Cellen linjene kan også brukes til å beskrive metastatisk faktorene. Her viser vi hvordan du bruker denne musemodell og cellelinjer å vurdere funksjonene til kandidat gener i svulst metastasering.
Mest kreft oppstår fra somatiske mutasjoner 1. Konvensjonelle genmodifiserte musen modeller (GEMM) har gitt betydelig innsikt i bidraget fra bestemte genetiske endringer tumorigenesis 2. De har imidlertid flere begrensninger. Den store ulempen av disse modellene er at de ikke sprer sporadiske natur tumor formasjon i mennesker, der bare noen celler innenfor en vev erverve genetiske endringer. Mutasjoner i transgene og knockout mus er også germline med påvirke utviklingen. Videre er disse musen modeller dyrt og tidkrevende.
Metastasering er et betydelig problem innen kreft. Modellering metastasering har vært vanskelig i GEMM. Spontan metastasering er sjelden i musen. Ventetid er lenge i GEMM metastasering 3penetrance er variabel. Eksperimentell metastasering modeller sysselsetter direkte injeksjon av celler i sirkulasjon av mus, så tidlig trinnene i metastatisk kaskade elimineres.
For å overvinne noen av over begrensningene i å studere metastatisk faktorer i musen modeller, har vi utviklet en bitransgenic musemodell, RIP-Tag; RIP-LiveTV4. Strategien er basert på å kombinere bruk av en svært synkronisert svulst progresjon musemodell, RIP-Tag 5, og reseptoren for undergruppe-A avian leukosis virus, tva 6,7. Denne RIP-Tag; RIP-LiveTVmusemodell gjør gener introduseres somatically i en enkelt bitransgenic musen belastning. SV40 T antigen undertrykke svulst undertrykkende funksjonene til Rb og p53, utvikle mus bukspyttkjertelen neuroendocrine svulster på en lignende måte til menneskelig tumorigenesis, med etapper inkludert hyperplasi, angiogenese, adenom og invasiv carcinoma. Denne RIP-Tag -modellen har vært svært lærerikt for vår forståelse av kjennetegnene av kreft, ikke begrenset til bukspyttkjertelen neuroendocrine svulster. Det er også brukt i preklinisk forsøk 8.
Vi presenterer en protokoll for somatiske genoverføring gjennom injeksjon av avian retroviruses intracardiacally i RIP-Tag; RIP-LiveTV mus. Vellykket infeksjon med RCASBP-avledet avian retroviruses krever aktivt voksende målcellene. Derfor valgte vi RIP-Tag; RIP-LiveTV mus for 7 ukens av alderen, når hyperplasia utvikler på ca 50% av bukspyttkjertelen øyene. Venstre ventrikkel intracardiac injeksjon av høy titer virus er nødvendig for å oppnå en infeksjon virkningsgrad på 10-20% 4. Før virus når bukspyttkjertelen holmer, reduserer dette leveringsmåte betydelig fortynning av virus partikler i sirkulasjon.
Bruker denne tilnærmingen, har vi tidligere vist at Bcl-xL fremmer kreft metastasering uavhengig av sin anti-apoptotisk funksjonen 4,9. Anti-apoptotisk-uavhengig metastatisk funksjonen ble ikke observert når Bcl-xL ble uttrykt via en transgene i alle bukspyttkjertelen β celler gjennom tumorigenic Ontogenese i RIP-Tag; RIP-Bcl-xL mus modell 10. Derfor tilbyr våre musemodell en unik mulighet til å identifisere og karakterisere gener funksjoner når uttrykt på et senere stadium av tumorigenesis. Fordi 2-4% av holmer utvikle i svulst i RIP-Tag; RIP-LiveTV bitransgenic mus uten viral infeksjon og ikke alle premalignant lesjoner er infisert med RCASBP-avledet avian retroviruses, bare faktorene som overdrar en selektiv fordel over den naturlige løpet av tumorigenesis kan identifiseres. Spesielt oppfattes metastatisk faktorer mest lett av denne metoden fordi metastasering bukspyttkjertelen lymfeknuter eller andre organer ikke vanligvis forekommer i RIP-Tag; RIP-LiveTV mus.
I denne studien beskrev vi en kraftig musemodell, RIP-Tag; RIP-LiveTV, å oppnå somatiske gen levering via avian retroviruses for identifikasjon og karakterisering av metastatisk faktorer. Selv om RIP-Tag; RIP-LiveTV mus utvikle bukspyttkjertelen neuroendocrine svulster, metastatisk faktorer i denne musemodell kan også fremme metastasering av andre typer kreft.
Vår tilnærming har fordelen av å innføre somatiske genetiske endringer spesifikt inn premalignant lesjoner av …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong og Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. støttes av DOD grant W81XWH-16-1-0619 og NIH grant 1R01CA204916.
RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
DMEM | Corning | 10-013-CV | |
fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
Superfect | Qiagen | 301305 | |
Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
Insulin Syringes | BD | 329461 | |
synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |