一个<em秀丽隐杆线虫</em基于营养状态的铜反转测定
Summary
在这里，我们提出了一种秀丽隐杆线虫特异性测定法，用于评估铜厌恶行为的变化和定位常见食物来源的能力，因为生物体从充足的营养状态进入饥饿的营养状态。
Abstract
为了确保生存，生物必须能够避免不利的栖息地，同时确保一致的食物来源。 秀丽隐杆线虫在检测到各种环境刺激后改变其运动模式，并可以调整其对饥饿状况的行为反应套件。当从食物源中取出超过30分钟时，线虫通常表现出降低的反应反应。观察响应于不断变化的营养状况的行为变化可以提供对调节从喂养到饥饿状态的过渡的机制的了解。
我们已经开发了一种测定线虫测量过渡障碍（ 即铜），然后在长时间内达到食物来源的能力。该协议基于以前的工作，通过以允许随着生物向a转移的持续数据收集的方式整合多个变量来构建n越来越饿了。此外，该测定允许增加的样品量，使得可以同时评估较大的线虫种群。
检测或响应铜的能力的生物有机体立即穿越化学屏障，野生型线虫最初被排斥。随着野生型蠕虫越来越缺乏，它们开始越过障碍并达到食物来源。我们设计了这种检测方法来评估一种不能应对各种环境线索的突变体，包括食物感觉或厌恶性化学物质的检测。当通过该方案进行评估时，有缺陷的生物体立即越过障碍物，但也不能检测食物来源。因此，尽管临时达到食物来源，这些突变体重复地跨越化学屏障。该测定可以直接测试蠕虫群体，以评估与厌恶和饥饿相关的潜在途径缺陷。
Introduction
秀丽隐杆线虫已经被用作研究神经生物学数十年的模型，因为分析仅由302个神经元组成的神经系统的电路相对容易1 。只要生物依赖于环境线索的响应，大部分神经系统都致力于调节环境信号的整合2 。尽管神经系统的简单， C.线虫可以检测和响应各种环境信号，包括驱避剂3 ，引诱剂4 ，温度5 ，甚至湿度6 。正确地整合环境信号的故障一直挂在哺乳动物模型系统7-9一些行为障碍和神经退行性条件。有一系列可用的神经疾病模型 在线虫中的 10种和线虫药物筛选11的发展，这种生物体已被证明是用于研究神经生物学的有用系统。鉴于线虫连接群1的可用性和线虫基因组12中几乎每个基因的突变，我们对线虫神经系统的理解以及我们自己的扩展都受到创造性地适合测定的设计的限制。
一些趋化实验已经开发在过去40年的线虫响应评估，以多样化的厌恶刺激3，4，13，14，15。初步实验涉及引入急性环境刺激，而单个蠕虫在琼脂板上漫游= “外部参照”> 3，14，16。记录了对运动反应的立即改变。例如，可以将挥发性气味辛醇施用于头发，并在线虫鼻前摆放，以刺激野生型蠕虫17中向后运动的开始。更复杂的实验也已经发展到包含多个变量作为评估行为选择18的手段。该测定的变化需要使用铜溶液以产生厌恶的中线屏障4 。引诱剂，即二乙酰基，被放置在化学屏障的一侧，蠕虫从二乙酰基源转移出去。蠕虫对铜的厌恶反应有缺陷，马上越过障碍达到二乙酰，而野生型蠕虫最初被屏障排斥。当蠕虫第一次接近铜屏障时，响应得分没有长期观察。
蠕虫在经历饥饿状况后进行评估，对环境刺激的敏感性降低19 。当厌恶的化学辛醇在线虫鼻前飘荡时，野生型生物体在食物中会在3-5秒内刺激向后的运动。在这些生物从食物中取出10分钟后，它们的延迟反应为8 – 10秒20 。因此，随着饥饿的增加，线虫对有害环境信号的反应显示出减少的反应，因为对食物的追求变得对生存更为重要。相反，过表达神经肽受体9（ npr-9）的线虫对食物上或食物上的辛醇没有反应，并且表现出无法应对许多厌恶刺激21 。这些npr-9（GF）生物体也不会在食物存在的情况下调节其逆转频率，但可以反对刺激刺激的刺激表示他们能够向后运动21 。鉴于它们表现出异常下降的食物反转频率，但可以在食物21的情况下调节其行为，因此我们还评估了npr-9（LF）突变体。耦合引进急性外界刺激的蠕虫的营养状况阐明由食品相关的途径大致可以调节感官信号传导机制已经资助途径22，23。食物在线虫环境中的存在也被用于评估乙醇提取反应24 。在该实验中，将蠕虫在不同浓度的乙醇中孵育，然后置于具有被称为“食物种族测定”的食品的琼脂平板上。食物贴片放置在盘子的一个边缘，而线虫w远离食物来源。通过测量蠕虫到达食物块所需的时间来评估乙醇抽出。
这种基于营养的铜避免测定建立在食物种族测定的基础上，以整合额外的环境变量，即食物和铜，同时评估随时间推移的行为变化。这是整个线虫群落中常用协议的改编4 。该方案已被用于评估厌恶反应和食物在四小时内的检测21 。由于蠕虫在食物剥夺30分钟后出现饥饿行为25 ，我们还可以评估营养状况的变化如何影响环境反应。该测定的条件测量实验生物随时间改变对厌恶刺激的反应性，因此评估行为变化生物进入饥饿状态（并持续测量长时间的饥饿）。由于npr-9（GF）动物不会改变他们对食物或许多厌恶线索的行为，我们试图确定这些行为缺陷是否会在饥饿的背景下持续存在。最终，该测定设计已经被配制为特异性地评估npr-9（GF）突变体，但是可以进一步适用于表征新菌株。
Protocol
Representative Results
Discussion
该测定设计修改了食物种族测定24，以包括铜溶液以产生厌恶的中线屏障并围绕板的边缘以防止线虫的丢失。测试生物体在四小时内穿过障碍物并达到食物补丁的能力。在npr-9（GF）的上下文中，我们利用该测定来评估饥饿条件如何影响厌食反应和食物检测。如果我们以前将npr-9（GF）表征为对食物和厌恶线索的反应性有缺陷，我们将多个环境线索与营养状况相结合，…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了加拿大自然科学与工程研究委员会发现授权RGPIN36481-08给William G. Bendena的支持。
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
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