UMA<em> Caenorhabditis elegans</em> Ensaio de Aversão ao Cobre Baseado em Status Nutricional
Summary
Aqui, apresentamos um ensaio específico de Caenorhabditis elegans projetado para avaliar mudanças no comportamento de aversão ao cobre e a capacidade de localizar uma fonte de alimento comum, à medida que o organismo progride de um estado nutricional bem alimentado para morrer de fome.
Abstract
Para garantir a sobrevivência, os organismos devem ser capazes de evitar habitats desfavoráveis, garantindo uma fonte consistente de alimentos. Caenorhabditis elegans alteram seus padrões de locomotriz após a detecção de diversos estímulos ambientais e podem modular seu conjunto de respostas comportamentais em resposta a condições de fome. Os nemematódios exibem tipicamente uma resposta aversiva diminuída quando removidos de uma fonte de alimento durante mais de 30 min. A observação de mudanças comportamentais em resposta a um estado nutricional em mudança pode fornecer informações sobre os mecanismos que regulam a transição de um estado bem alimentado para um estado de fome.
Nós desenvolvemos um ensaio que mede a capacidade de um nematóide de atravessar uma barreira aversiva ( isto é, cobre) e chegar a uma fonte de alimento durante um período prolongado de tempo. Este protocolo baseia-se no trabalho anterior, integrando múltiplas variáveis de forma a permitir a coleta contínua de dados à medida que os organismos se deslocam para umaN condição cada vez mais fome. Além disso, este ensaio permite um aumento do tamanho da amostra para que populações maiores de nemátodos possam ser avaliadas simultaneamente.
Os organismos defeituosos para a capacidade de detectar ou responder ao cobre imediatamente atravessam a barreira química, enquanto os nemátodos de tipo selvagem são inicialmente repelidos. À medida que os vermes de tipo selvagem estão cada vez mais famintos, eles começam a atravessar a barreira e chegar à fonte de alimento. Nós projetamos este ensaio para avaliar um mutante incapaz de responder a diferentes pistas ambientais, incluindo a sensação de alimentos ou a detecção de produtos químicos aversivos. Quando avaliados através deste protocolo, os organismos defeituosos atravessaram imediatamente a barreira, mas também foram incapazes de detectar uma fonte de alimento. Portanto, esses mutantes atravessam repetidamente a barreira química apesar de terem chegado temporariamente a uma fonte de alimento. Este ensaio pode facilmente testar populações de vermes para avaliar potenciais defeitos de via relacionados à aversão e à fome.
Introduction
Caenorhabditis elegans tem sido usado como modelo para o estudo da neurobiologia por décadas devido à relativa facilidade na análise dos circuitos de um sistema nervoso composto de apenas 302 neurônios 1 . Desde que o organismo dependa de responder a pistas ambientais, grande parte do sistema nervoso é dedicado a regular a integração de sinais ambientais 2 . Apesar da simplicidade de seu sistema nervoso, C. elegans pode detectar e responder a diversos sinais ambientais, incluindo repelentes 3 , atrativos 4 , temperatura 5 e até mesmo umidade 6 . A incapacidade de integrar adequadamente os sinais do ambiente tem sido associada a uma série de distúrbios comportamentais e doenças neurodegenerativas em sistemas modelo de mamíferos 7- 9. Com uma gama de modelos disponíveis de doença neural 10 em C. elegans e o desenvolvimento de telas farmacêuticas de nemátodos 11 , este organismo provou ser um sistema útil para o estudo da neurobiologia. Dada a disponibilidade de um conector de nemátodos cartografado 1 e mutações para quase todos os genes do genoma 12 do nematóide, nossa compreensão do sistema nervoso do nematóide e, por extensão, a nossa própria, é parcialmente limitada pelo desenho de ensaios criativos apropriados.
Uma série de ensaios de quimiotaxia foram desenvolvidos ao longo dos últimos 40 anos para avaliar a resposta de nematóides a diversos estímulos aversivos 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . A experimentação inicial envolveu a introdução de um estímulo ambiental agudo enquanto um único verme vagava em uma placa de ágar= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Mudanças imediatas nas respostas locomotrizas foram registradas. Por exemplo, o octanol injetável volátil pode ser aplicado a um cabelo e flutuou na frente do nariz de um nematóide para estimular o início da locomoção para trás em vermes selvagens 17 . Ensaios mais complexos também foram desenvolvidos para incorporar variáveis múltiplas como meio de avaliar a escolha comportamental 18 . Uma variação deste ensaio implica o uso de uma solução de cobre para criar uma barreira da linha média aversiva 4 . Um atrativo, a saber, diacetil, foi colocado em um lado da barreira química com os vermes transferidos para fora da fonte de diacetilo. Worms defeituoso para as respostas de aversão ao cobre imediatamente atravessou a barreira para atingir o diacetil, enquanto que as vermes do tipo selvagem foram inicialmente repelidas pela barreira. As respostas foram marcadas quando os vermes se aproximaram pela barreira de cobreSem observações de longo prazo.
Quando os vermes são avaliados depois de sofrerem condições de fome, sua sensibilidade aos estímulos ambientais diminui 19 . Quando o octanol químico aversivo é conduzido na frente do nariz dos nematóides, os organismos de tipo selvagem estimulam o movimento para trás dentro de 3 a 5 s quando em alimentos. Após estes organismos terem sido removidos dos alimentos durante 10 min, eles apresentam uma resposta tardia de 8-10 s 20 . Assim, com o aumento da fome, os nemátodos exibem uma resposta aversiva diminuída aos sinais ambientais prejudiciais, uma vez que a busca de alimentos se torna mais essencial para a sobrevivência. Por outro lado, os nemátodos que exageram o receptor neuropéptido 9 ( npr-9) , não respondem ao octanol sobre ou fora dos alimentos e apresentam incapacidade de responder a uma série de estímulos aversivos 21 . Esses organismos npr-9 (GF) também não modulam sua freqüência de reversão na presença de alimentos, mas podemInverter em resposta a estímulos tácteis agressivos, indicando que eles são capazes de locomoção para trás 21 . Nós também avaliamos os mutantes npr-9 (LF), dado que eles exibem uma freqüência de reversão anormalmente diminuída dos alimentos, mas podem modular seu comportamento na presença de alimentos 21 . O acasalamento do estado nutricional do sem-fim com a introdução de estímulos externos agudos ajudou a elucidar os mecanismos pelos quais uma via relacionada ao alimento pode modular amplamente as vias de sinalização sensorial 22 , 23 . A presença de alimentos no ambiente de nemátodos também foi usada para avaliar respostas de retirada de etanol 24 . Neste experimento, os vermes foram incubados em diferentes concentrações de etanol e depois foram colocados em uma placa de ágar com um remendo de alimento conhecido como "ensaio de raça alimentar". O parto de comida foi colocado em uma borda da placa enquanto os nematóides wAntes da distância da fonte de comida. A retirada de etanol foi avaliada medindo a duração do tempo necessário para que os vermes alcancem o remendo de alimentos.
Este ensaio de aversão de cobre com base em nutrientes baseia-se no ensaio da raça alimentar para integrar variáveis ambientais adicionais, nomeadamente alimentos e cobre, ao mesmo tempo que avaliam as mudanças comportamentais ao longo do tempo. Esta é uma adaptação de um protocolo de uso comum em toda a comunidade C. elegans 4 . Este protocolo tem sido utilizado para avaliar respostas aversivas e a detecção de alimentos ao longo de um período de quatro horas 21 . Uma vez que os comportamentos de fome de exibição de vermes após 30 minutos de privação de alimentos 25 , também podemos avaliar como as mudanças no estado nutricional podem influenciar as respostas ambientais. As condições deste ensaio medem como os organismos experimentais alteram a capacidade de resposta aos estímulos aversivos ao longo do tempo, portanto, avalia as mudanças comportamentais comoOs organismos progridem para um estado de fome (e continuam as medidas de fome prolongada). Uma vez que os animais npr-9 (GF) não alteram seu comportamento em resposta a alimentos ou muitas pistas aversivas, buscamos identificar se esses déficits comportamentais persistiriam no contexto da fome. Em última análise, este design de ensaio foi formulado para avaliar especificamente os mutantes npr-9 (GF), mas pode ser ainda adaptado para caracterizar novas variedades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este design de ensaio modifica o ensaio de ração alimentar 24 para incluir uma solução de cobre para criar uma barreira da linha média aversiva e ao redor da borda da placa para evitar a perda de nemátodos. Os organismos são testados quanto à sua capacidade de atravessar a barreira aversiva e alcançar um parto alimentar ao longo de um período de 4 h. No contexto de npr-9 (GF) , utilizamos este ensaio para avaliar como as condições de inanição podem a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant RGPIN36481-08 para William G. Bendena.
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
Referências
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
- Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
- Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer’s disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
- Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson’s and Huntington’s disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- O’Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. , 247-253 (2014).
- Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
- Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
- Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
- Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
- Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
- Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
- Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
- Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
- Hart, A. C. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
- Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
- Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
- Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).
