<em> Caenorhabditis elegans</em> Анализ на основе меди на основе питательных веществ
Summary
Здесь мы представляем специфический анализ Caenorhabditis elegans, предназначенный для оценки изменений поведения отвращения меди и способности находить общий источник пищи, так как организм развивается из сытого и голодного состояния питания.
Abstract
Чтобы обеспечить выживание, организмы должны быть способны избегать неблагоприятных мест обитания, обеспечивая при этом постоянный источник пищи. Caenorhabditis elegans изменяют свои локомоторные закономерности при обнаружении разнообразных экологических стимулов и могут модулировать их набор поведенческих реакций в ответ на условия голодания. Нематоды обычно проявляют сниженный отвратительный ответ при удалении из источника пищи в течение более 30 мин. Наблюдение за поведенческими изменениями в ответ на меняющийся статус питания может дать представление о механизмах, которые регулируют переход от хорошо питающегося к голодному состоянию.
Мы разработали анализ, который измеряет способность нематоды пересекать барьер аверсивного действия ( то есть медь), затем достигает источника пищи в течение длительного периода времени. Этот протокол основывается на предыдущей работе, интегрируя несколько переменных таким образом, который позволяет продолжать сбор данных, когда организмы смещаются в сторонуN все более голодное состояние. Более того, этот анализ позволяет увеличить размер выборки, чтобы одновременно можно было оценить большую популяцию нематод.
Организмы, дефектные для способности обнаруживать или реагировать на медь, немедленно пересекают химический барьер, в то время как нематоды дикого типа изначально отталкиваются. Поскольку черви типа дикого типа становятся все более голодными, они начинают пересекать барьер и достигать источника пищи. Мы разработали этот анализ для оценки мутанта, который неспособен реагировать на различные экологические сигналы, включая пищевые ощущения или обнаружение отвратительных химических веществ. При оценке по этому протоколу дефектные организмы немедленно пересекали барьер, но также не могли обнаружить источник пищи. Следовательно, эти мутанты неоднократно пересекают химический барьер, несмотря на временное достижение источника пищи. Этот анализ может прямо проверять популяции червей для оценки потенциальных дефектов пути, связанных с отвращением и голоданием.
Introduction
Caenorhabditis elegans использовался как модель для изучения нейробиологии в течение десятилетий из-за относительной легкости анализа схем нервной системы, состоящей только из 302 нейронов 1 . При условии, что организм зависит от реагирования на экологические сигналы, большая часть нервной системы предназначена для регулирования интеграции экологических сигналов 2 . Несмотря на простоту своей нервной системы, C. elegans может обнаруживать и реагировать на различные экологические сигналы, включая репелленты 3 , аттрактанты 4 , температуру 5 и даже влажность 6 . Неспособность надлежащим образом интегрировать экологические сигналы были связаны с рядом поведенческих расстройств и нейродегенеративных состояний в модельных системах млекопитающих 7- 9. С рядом доступных моделей нейронных заболеваний 10 в C. elegans и разработке фармацевтических экранов 11 нематод, этот организм оказался полезной системой для изучения нейробиологии. Учитывая наличие сопоставленного нематодного соединения 1 и мутаций почти для каждого гена в геноме 12 нематоды, наше понимание нервной системы нематод и, в свою очередь, наше собственное, частично ограничено разработкой творчески подходящих анализов.
За последние 40 лет был разработан ряд анализов хемотаксиса для оценки реакции нематод на различные отклонения от априорных стимулов 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . Первоначальные эксперименты включали введение острого экологического стимула, в то время как один червь, брошенный на агаровой пластине= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Были зафиксированы немедленные изменения в локомоторных ответах. Например, летучий октанол одоранта можно наносить на волосы и доноситься перед носом нематоды, чтобы стимулировать инициирование обратной локомоции у червей дикого типа 17 . Были также разработаны более сложные анализы для включения нескольких переменных в качестве средства оценки поведенческого выбора 18 . Вариант этого анализа влечет за собой использование медного раствора для создания протективного срединного барьера 4 . Аттрактант, а именно диацетил, помещался с одной стороны химического барьера с червями, перенесенными из диацетильного источника. Черви, дефектные для медных отвратительных реакций, немедленно пересекали барьер, чтобы достичь диацетила, в то время как черви типа дикого типа первоначально были отбиты барьером. Ответы были оценены, когда черви впервые приблизились к медной барьерБез долгосрочных наблюдений.
Когда черви оцениваются после условий голодания, их чувствительность к экологическим стимулам снижается 19 . Когда аверсивный химический октанол доносится до носа нематоды, организмы дикого типа стимулируют движение назад в течение 3-5 секунд при еде. После того как эти организмы были удалены из пищи в течение 10 мин, они проявляют задержанный ответ 8 – 10 с 20 . Таким образом, при повышенном голодании нематоды проявляют сниженный отвратительный ответ на вредные экологические сигналы, поскольку поиск пищи становится более важным для выживания. Напротив, нематоды, которые экспрессируют нейропептидный рецептор 9 ( npr-9) , не реагируют на октанол на или вне пищи и проявляют неспособность реагировать на ряд отвратительных стимулов 21 . Эти npr-9 (GF) организмы также не модулируют свою частоту разворота в присутствии пищи, но могутОбратные в ответ на суровые прикосновения, указывающие на то, что они способны к обратной локомоции 21 . Мы также оценили мутанты npr-9 (LF), учитывая, что они проявляют аномально уменьшенную частоту разворота от пищи, но могут модулировать их поведение в присутствии пищи 21 . Сочетание состояния питания червя с внедрением острых внешних раздражителей помогло в выяснении механизмов, с помощью которых связанный с пищей путь мог широко модулировать сенсорные сигнальные пути 22 , 23 . Присутствие пищи в среде нематод также использовалось для оценки ответов на вывод этанола 24 . В этом эксперименте черви инкубировали в различных концентрациях этанола и затем помещали на агаровую пластину с патчем с пищей, известным как «анализ расы пищи». Патч для еды был помещен на один край пластины, а нематоды wОтделяются от источника пищи. Вывод этанола оценивали путем измерения продолжительности времени, необходимого для того, чтобы черви достигли участка пищи.
Этот анализ на основе питания, основанный на питании, основан на анализе продовольственной расы для интеграции дополнительных переменных окружения, а именно продуктов питания и меди, при оценке изменений поведения с течением времени. Это адаптация широко используемого протокола в сообществе C. elegans 4 . Этот протокол использовался для оценки аверсивных ответов и обнаружения пищи в течение четырехчасового периода 21 . Поскольку поведение вирусов, вызывающих голод червя после 30 минут депривации пищи 25 , мы также можем оценить, как изменения состояния питания могут влиять на экологические реакции. Условия этого анализа измеряют, как экспериментальные организмы изменяют отзывчивость к аверсивным стимулам с течением времени, следовательно, это оценивает поведенческие изменения какОрганизмы продвигаются к голодному состоянию (и продолжают измерения продолжительного голодания). Поскольку животные npr-9 (GF) не изменяют свое поведение в ответ на пищу или многие аверсивные сигналы, мы стремились определить, сохраняются ли эти поведенческие дефициты в контексте голодания. В конечном счете, эта конструкция анализа была разработана для специфической оценки мутантов npr-9 (GF), но может быть дополнительно адаптирована, чтобы также характеризовать новые штаммы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта конструкция анализа изменяет анализ 24 продовольственной гонки, чтобы включить медный раствор для создания протективного срединного барьера и вокруг края пластины, чтобы предотвратить потерю нематод. Организмы тестируются на их способность преодолевать протективны?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Советом исследований естественных наук и инженерных исследований Канады Discovery Grant RGPIN36481-08 Уильяму Г. Бендене.
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
Referências
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
- Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
- Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer’s disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
- Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson’s and Huntington’s disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- O’Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. , 247-253 (2014).
- Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
- Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
- Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
- Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
- Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
- Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
- Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
- Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
- Hart, A. C. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
- Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
- Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
- Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).
