EEN<em> Caenorhabditis elegans</em> Voedingsstatus gebaseerde Koper Aversion Assay
Summary
Hier presenteren we een Caenorhabditis elegans -specifieke test die is ontworpen om veranderingen in het koperen aversiegedrag te evalueren en het vermogen om een gemeenschappelijke voedingsbron te lokaliseren, als het organisme zich voortbrengt van een goed gevoed aan hongerige voedingswaarde.
Abstract
Om overleving te waarborgen, moeten organismen ongunstige habitats kunnen vermijden, terwijl er een consistente voedingsbron wordt gewaarborgd. Caenorhabditis elegans veranderen hun bewegingspatronen bij het opsporen van uiteenlopende milieu-stimuli en kunnen hun suite van gedragsresponsen moduleren in reactie op de hongersnoodstoestanden. Nematodes vertoonden typisch een verminderde aversieve reactie wanneer ze verwijderd worden uit een voedingsbron gedurende meer dan 30 minuten. Observatie van gedragsveranderingen als reactie op een veranderende voedingsstatus kan inzicht geven in de mechanismen die de overgang regelen van een goed gevoed tot hongerige toestand.
We hebben een test ontwikkeld die het vermogen van een nematode om een aversieve barrière ( dwz koper) te overtreffen, dan een voedingsbron over een langere periode bereikt. Dit protocol bouwt voort op eerdere werkzaamheden door meerdere variabelen te integreren op een manier die de continuïteit van gegevensverzameling mogelijk maakt, aangezien de organismen verschuiven naar aN steeds meer hongerige toestand. Bovendien maakt deze bepaling een verhoogde steekproefgrootte mogelijk, zodat grotere populaties nematoden tegelijk kunnen worden geëvalueerd.
Organen die defect zijn voor het detecteren of reageren op koper, kruisen de chemische barrière direct door, terwijl wildtype nematoden aanvankelijk afstoten. Omdat wilde worms steeds meer honger krijgen, beginnen ze de barrière over te gaan en de voedselbron te bereiken. We hebben deze analyse ontworpen om een mutant te beoordelen die niet in staat is om te reageren op diverse milieueisen, waaronder voedselenspanning of detectie van aversieve chemicaliën. Bij het evalueren via dit protocol stonden de defecte organismen onmiddellijk door de barrière, maar waren ook niet in staat om een voedingsbron te detecteren. Daarom kruisen deze mutanten de chemische barrière herhaaldelijk ondanks het tijdelijk bereiken van een voedingsbron. Deze test kan rechtstreeks testen populaties van wormen om potentiële wegdefecten in verband met afkeer en hongersnood te evalueren.
Introduction
Caenorhabditis elegans is al decennia gebruikt als model voor de studie van neurobiologie door het relatieve gemak bij het analyseren van de circuits van een zenuwstelsel dat uit slechts 302 neuronen 1 bestaat . Met dien verstande dat het organisme afhankelijk is van het reageren op milieu-signalen, is veel van het zenuwstelsel gewijd aan het regelen van de integratie van milieu-signalen 2 . Ondanks de eenvoud van het zenuwstelsel kan C. elegans detecteren en reageren op diverse milieusignalen, waaronder afweermiddelen 3 , attractants 4 , temperatuur 5 en zelfs luchtvochtigheid 6 . Een niet omgevingssignalen goed geïntegreerd is gekoppeld aan een aantal gedrags- stoornissen en neurodegeneratieve ziekten in zoogdieren modelsystemen 7- 9. Met een reeks beschikbare neurale ziekte modellen 10 de C. elegans en de ontwikkeling van nematode farmaceutische schermen 11 , dit organisme heeft bewezen een nuttig systeem te zijn voor de studie van neurobiologie. Gezien de beschikbaarheid van een toegekende nematode Connectome 1 en mutaties voor bijna elk gen in het nematode genoom 12 , is ons begrip van het nematode zenuwstelsel, en door onszelf zelf, gedeeltelijk beperkt door het ontwerpen van creatief passende analyses.
In de afgelopen 40 jaar zijn een aantal chemotaxis-analyses ontwikkeld om de respons van de nematoden op diverse afersieve stimuli 3 , 4 , 13 , 14 , 15 te evalueren. Aanvankelijke experimenten betroffen de introductie van een acute milieustimulus terwijl een enkele worm op een agarplaat stond= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Onmiddellijke veranderingen in de locomotorische reacties werden geregistreerd. Bijvoorbeeld, kan de vluchtige geurstof octanol op een haar worden aangebracht en wafted voor een neus van de nematode om de initiëring van achterwaartse beweging in wilde worms 17 te stimuleren. Meer complexe analyses zijn ook ontwikkeld om meerdere variabelen op te nemen als middel om gedragskeuze te beoordelen 18 . Een variatie van deze analyse houdt in dat er een koperoplossing wordt gebruikt om een aversive midline barrier 4 te creëren. Een attractant, namelijk diacetyl, werd aan één kant van de chemische barrière geplaatst met worms die van de diacetylbron werden overgebracht. Worms defect voor koperen aversieve reacties kwamen direct over de barrière om de diacetyl te bereiken, terwijl wilde worms aanvankelijk door de barrière werden afgestoten. Reacties werden behaald toen worms de koperbarrière eerst naderdenZonder lange termijn waarnemingen.
Wanneer wormen worden geëvalueerd na het hebben van hongerstoestanden, is hun gevoeligheid voor milieu-stimuli afgenomen 19 . Wanneer de aversieve chemische octanol wafted voor de nematode neus, wild-type organismen stimuleren terugwaartse beweging binnen 3 – 5 s bij het eten. Nadat deze organismen gedurende 10 minuten uit voedsel zijn verwijderd, vertoonden ze een vertraagde respons van 8 – 10 s 20 . Dus met verhoogde hongersnood vertoont nematoden een afgenomen respons op schadelijke milieudesignen, aangezien de zoektocht naar voedsel essentieel is voor overleving. Omgekeerd reageren nematoden die overexpressieve neuropeptide receptor 9 ( npr-9) niet reageren op octanol op of uit eten en tonen het onvermogen om te reageren op een aantal aversieve stimuli 21 . Deze npr-9 (GF) organismen moduleren ook hun omkeerfrequentie niet in aanwezigheid van voedsel, maar kanOmgekeerd in reactie op harde aanraakstimulaties die aanwijzen dat zij in staat zijn om achteruit voortbewegen 21 . We hebben ook npr-9 (LF) mutanten geëvalueerd, aangezien zij een abnormaal verminderde omkeerfrequentie vertoonden uit voedsel, maar hun gedrag kunnen moduleren in aanwezigheid van voedsel 21 . Het koppelen van de voedingsstaat van de worm met de introductie van acute externe stimuli heeft geholpen bij het uitleggen van de mechanismen waardoor een voedingsgerelateerde pathway de sensorische signaleringsbanen 22 , 23 breed kan moduleren. De aanwezigheid van voedsel in de nematodeomgeving is ook gebruikt om ethanol-terugtrekkingsreacties te evalueren 24 . In dit experiment werden worms geïncubeerd in verschillende concentraties ethanol en vervolgens op een agarplaat geplaatst met een flardje voedsel dat bekend staat als een "voedselrace-assay". Het etenstapje werd op één rand van de plaat geplaatst terwijl de nematoden wEr is weggelegd van de voedselbron. Ethanol-terugtrekking werd geëvalueerd door het meten van de tijdsduur die nodig is voor wormen om de patch van voedsel te bereiken.
Deze voedingsgebaseerde kopersaversie-analyse bouwt voort op de voedselrace-analyse om extra milieu-variabelen, namelijk voedsel en koper, te integreren, terwijl gedragsveranderingen in de loop van de tijd worden beoordeeld. Dit is een aanpassing van een algemeen gebruik protocol in de C. elegans community 4 . Dit protocol is gebruikt om aversieve reacties en de detectie van voedsel over een periode van vier uur 21 te beoordelen . Aangezien worm's honger gedrag na 30 minuten voedselafbraak 25 is , kunnen we ook evalueren hoe veranderingen in de voedingsstatus de milieueffecten kunnen beïnvloeden. De condities van deze analyse bepalen hoe experimentele organismen de responsiviteit van de aversieve stimuli over de tijd veranderen, waardoor dit gedragsveranderingen alsOrganismen vorderen naar een hongerde toestand (en voortdurende metingen van langdurige hongersnood). Aangezien de npr-9 (GF) dieren hun gedrag niet veranderen in verband met voedsel of veel aversieve signalen, trachten we te identificeren of deze gedragsmatige tekorten zouden voortzetten in het kader van hongersnood. Uiteindelijk is dit assay ontwerp geformuleerd om de npr-9 (GF) mutanten specifiek te evalueren, maar kan verder aangepast worden om ook nieuwe stammen te karakteriseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit assayontwerp wijzigt de voedselrace-analyse 24 om een koperoplossing op te nemen om een aversieve middenlijnbarrière en rond de rand van de plaat te creëren om verlies van nematoden te voorkomen. Organismen worden getest op hun vermogen om de aversieve barrière over te halen en een voedsel patch te bereiken over een periode van 4 uur. In het kader van npr-9 (GF) hebben we deze test gebruikt om te beoordelen hoe hongersnoodsituaties afkeerbare reacties en de detectie va…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Natuurwetenschappen en Technische Onderzoeksraad van Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 aan William G. Bendena.
Materials
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
Referências
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
- Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
- Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer’s disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
- Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson’s and Huntington’s disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
- Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
- O’Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. , 247-253 (2014).
- Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
- Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
- Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
- Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
- Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
- Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
- Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
- Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
- Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
- Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
- Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
- Hart, A. C. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
- Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
- Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
- Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
- Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
- Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).
