Summary
Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.
Abstract
L’existence de cellules endothéliales progénitrices (EPCs) dans le sang périphérique et son implication dans la vasculogénèse a été signalée par Ashara et ses collègues1. Plus tard, d’autres documenté l’existence de types similaires de EPCs provenant de la moelle osseuse2,3. Plus récemment, Yoder et Ingram a révélé que EPCs provenant du sang de cordon ombilical avaient un potentiel prolifératif plus élevé par rapport à ceux isolés d’adulte périphérique de sang4,5,6. En dehors de n’être impliqué en postnatal vasculogénèse, EPCs ont également montré des promesse comme une source de cellules pour créer tissulaire cardiaque et vasculaire vanne constructions7,8. Il existe différents protocoles d’isolement, dont certaines impliquent le tri cellulaire des cellules mononucléaires (PTM) dérivés les sources mentionnées plus tôt avec l’aide de marqueurs endothéliales et hématopoïétiques, ou cultivant ces multinationales avec la croissance endothéliale spécialisée moyenne, ou une combinaison de ces techniques9. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et culture des CPE à l’aide spécialisée endothélial additionné de facteurs de croissance, sans utiliser d’immunosorting, suivie de la caractérisation des cellules isolées à l’aide de Western Blot et immunomarquage.
Introduction
Plusieurs chercheurs ont étudié les caractéristiques et le potentiel humain EPCs5,10,11,12,13. CPE peut être qualifiée de circuler les cellules qui ont la capacité d’adhérer aux tissus endothéliales dans les sites d’hypoxie, ischémie, des blessures ou la formation de tumeurs et contribuent à la formation de nouvelles structures vasculaires4,14. Leur implication observée dans la néovascularisation, sous forme de vasculogénèse postnatal, a conduit à la compréhension de la physiopathologie de ces cellules et leur utilisation dans des applications thérapeutiques4,15, 16. le nombre de CPE chez un individu s’est avéré être en corrélation avec la pathologie cardiovasculaire9,15,16,17,18,19 ,,20. D’autres études ont également différenciées EPCs dans un phénotype de fibroblastes-comme soupape et proposé que ces cellules pourraient être utilisées pour l’ingénierie tissulaire cardiaque vannes7,21.
Les molécules de surface de cellule particulière nécessaires pour isoler les EPCs n’ont pas été clairement identifiés en raison de divergences entre les enquêtes4. L’adhérence des multinationales à une certaine matrice, avec une exposition à une variété de conditions de culture, a été interprétée par plusieurs groupes1,17,22,23, suggérant que putatifs EPCs peuvent afficher les différentes propriétés phénotypiques. Ces propriétés incluent un manque de capacité de phagocytose, la formation du tube en Matrigel et la captation des lipoprotéines de basse densité Dil-acétylé. La haute clonogéniques et potentiel prolifératif sont deux propriétés avec laquelle EPCs peuvent être hiérarchisés5. CPE peut également former des tubules in vitro lorsque co-cultivées avec des poumons foetaux humains fibroblastes4. Ces cellules sont connues pour exprimer des marqueurs de surface des cellules endothéliales et de partager certaines des marqueurs hématopoïétiques13,24,25. Les marqueurs positivement exprimées largement acceptées pour le phénotypage EPCs sont CD31, CD34, récepteur de facteur de croissance endothélial vasculaire 2 (VEGFR2), von Willebrand (vWF) de facteur, CD133, c-Kit et vasculaires endothéliales cadhérine (VE-cadhérine)4 , 18. cellules qui expriment conjointement CD90, CD45, CD14, CD115 ou actine muscle lisse-alpha (α-SMA) ne sont pas considérés comme être EPCs en raison de leur capacité potentielle, proliférative limitée à phagocyter les bactéries et incapacité de former de novo humaine navires en vivo4,7. Cet article décrit un protocole modifié pour l’isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain sans besoin de n’importe quelle cellule protocoles de tri. Pour cet article, nous avons utilisé le CD31, CD34 et VEGFR2 comme les marqueurs positifs, avec α-SMA comme indicateur négatif.
Dans cet article, nous proposons une méthode d’isoler et de cultiver des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical sans cellule tri à l’aide spécialisée de milieu de croissance endothéliale additionné de facteurs de croissance (EGM). Cette EGM contient le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance fibroblastique (FGF), qui améliorent la survie, la prolifération et la migration des cellules endothéliales26. Il comprend également l’acide ascorbique, qui est responsable du maintien de la morphologie de pavées des cellules ; insuline-comme le facteur de croissance-1 (IGF-1), qui fournit angiogénique et fonction migrateur ; et l’héparine, ce qui provoque la meilleure stabilité à long terme des facteurs de croissance en moyenne26. Autres facteurs de croissance, ajoutés le milieu de culture de cellules endothéliales comprend une supplémentation en facteur de croissance épidermique (EGF), qui aide à stimuler la prolifération cellulaire et la différenciation et hydrocortisone, qui sensibilise les cellules à EGF26 . Nous montrons que l’utilisation de ce support de croissance spécifique conduit à un nombre plus élevé de l’EPCs par rapport à la moyenne basale endothéliale (EBM) ou moyen d’Eagle modifié (DMEM de Dulbecco).
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Protocol
cette recherche a été menée avec l’approbation de l’Université de l’Arkansas, Institutional Review Board (numéro d’agrément 16-04-722). Unités de sang de cordon ombilical ont recueilli dans une solution de dextrose (CPD) citrate phosphate à l’Arkansas Cord Blood Bank, et les unités qui ne respectent pas l’obligation de stockage ont été données pour la recherche. Unités de sang de cordon ont été envoyées au laboratoire au sein de la collection à une température ambiante de 24 h.
1. isolement des progénitrices endothéliales de sang de cordon
- préparation des réactifs.
- Préparer EGM en ajoutant le milieu basal endothélial (EBM) à 10 % sérum fœtal (SVF) additionné de 20 ng/mL de facteur de croissance analogue à l’insuline (IGF), 1 µg/mL d’acide ascorbique, 5 ng/mL recombinant facteur humain de croissance épidermique (rhEGF), 22,5 µg/mL héparine et 0,5 ng/mL endothéliales facteur de croissance vasculaire (VEGF), ainsi que de 10 ng/mL de recombinant humain facteur de croissance fibroblastique B (rhFGF-B), 0,2 µg/mL hydrocortisone et 2 % la pénicilline-streptomycine-glutamine. Stériliser le milieu de culture à l’aide d’un filtre à membrane vide 0,2 µm polyéthersulfone (PES). Rat
- Prepare queue j’ai une solution de collagène à une concentration de 50 µg/mL à l’aide de l’acide acétique 0,02 N. Stériliser cette solution à l’aide d’un filtre de seringue 0,2 µm. Plaques 6 puits
- pré-couche avec 2 mL de rat préparé j’ai tail solution de collagène pour chaque puits. Placez-les dans un incubateur maintenu à 5 % de CO 2 et 37 ° C pendant au moins 1 h avant de semer.
- Diluer environ 25 mL de sang de cordon avec Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) à une concentration de 1:1.
- Prepare radio-immuno précipitation assay (RIPA) tampon à l’aide de chlorure de sodium 150 mM, 1 % X-100 Triton, désoxycholate de sodium 0,5 %, β-glycérophosphate de 1 mM, SDS 0,1 % et 50 mM Tris (pH 8,0).
- Isolement de cellules endothéliales progénitrices.
- Tout chaud préparé réactifs dans un bain d’eau maintenu à 37 ° C avant l’isolement.
- Ajouter 20 mL de réactif moyen gradient de densité dans un tube à centrifuger 50 mL.
- Soigneusement la couche 20 mL de sang de cordon dilué dans le tube à centrifuger contenant le milieu de gradient de densité sans casser cette couche en visant la pipette vers les parois du tube.
- Séparer les composants du sang issu de leur densité ( Figure 1) par centrifugation à 800 g pendant 30 min à température ambiante, avec le frein du rotor centrifuge au large. Ne pas déranger les différentes couches.
- Enlever la couche de plasma par pipetage soigneusement il hors du tube sans déranger les autres cellules de la couche couches jusqu'à ce que la pointe de pipette est en mesure d’atteindre le RNM (voir Figure 1). Jeter le plasma enlevé.
Remarque : Lors de l’utilisation de pointes de pipette pour retirer le plasma, laisser une petite couche de plasma au-dessus de la couche MNC ( Figure 1) pour réduire les turbulences. - Recueillir la couche leuco-plaquettaire qui contient les multinationales à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de calibre 18 et le transférer dans un tube à centrifuger fraîche.
- Ajouter un volume égal d’EBM à la centrifugeuse EMNs. collectées ces tubes à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C. jeter le surnageant.
Remarque : Le culot cellulaire apparaissent en rouge à cause de la présence de globules rouges/érythrocytes. - Ajouter 5 mL de solution de chlorure d’ammonium à lyser les globules rouges. Incuber à ce tube sur la glace pendant 5-10 min, avec agitation occasionnels.
NOTE : Attention doit être prise pendant cette étape à ne pas dépasser la durée de temps, car il peut être nocif pour les multinationales. - Centrifuger les tubes à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Si les érythrocytes persistent, répéter les étapes 1.2.8 et 1.2.9 jusqu'à ce qu’aucune couleur rouge n’est observée dans le culot.
- Resuspendre le culot dans EGM préparé et utilisez l’hémocytomètre pour compter les PTM.
- Aspirer le rat j’ai tail collagène recouvert de plaque 6 puits (de l’étape 1.1.3) et laver les puits trois fois avec 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Graines le culot de RNM resuspendu dans EGM à la plaque de collagène à une concentration de 1 x 10 7 multinationales dans chaque puits. Placez-le dans le 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur.
- Après 24 h, aspirer le milieu et laver les puits une fois avec EGM. Ajouter 3 mL de milieu EGM dans chaque puits et placez-le dans le 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur.
- Reconstituer la plaque avec un milieu EGM frais tous les jours pendant 7 jours. Après 7 jours, changer le milieu EGM alternats.
- à l’aide d’un microscope en champ clair, prendre des images de la plaque 6 puits tous les jours pour suivre la progression des colonies de cellules endothéliales. Marquer la plaque lorsque les colonies se présentent pour garder une trace de leur croissance.
Remarque : Il faut généralement entre 5 et 9 jours pour les colonies apparaissent dans la culture.
- Expansion des cellules endothéliales progénitrices.
- Manteau le flacon de culture T-25 avec rat queue j’ai collagène (50 µg/mL) et placez-le dans le 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur au moins 60 min. aspirer et laver le flacon de culture cellulaire T-25 trois fois avec du PBS 1 x avant le semis des cellules.
- Trypsinize des colonies de cellules endothéliales lorsqu’ils atteignent environ 3 mm de taille à l’aide de 150 µL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % dans chaque puits. Replacez la plaque 6 puits dans les 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur pour 2-3 min.
- Tapoter légèrement la plaque 6 puits pour déloger les cellules attachées. Immédiatement ajouter 2 mL d’EGM et récupérer les cellules dans un tube à centrifuger 15 mL.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculer la densité de semis initiale.
- Spin la centrifugeuse 15 mL tubes à 400 g pendant 5 min. Resuspendre le culot dans EGM et la fiole T-25 ~ 500 000 cellules des graines. Marquer cette fiole en tant que Passage 1 et placer le ballon de T-25 retour dans les 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur.
Remarque : Les cellules peuvent être plaqués en EBM et DMEM pour comparer la croissance avec EGM. - Pour plus amples passages, lorsque le ballon atteint 90 % confluence, suivez les étapes 1.3.1 - 1.3.5 et réensemencer les cellules à 10 4 cellules/cm 2 sur T-75 ou T-175 flacons de culture cellulaire. Procéder à la caractérisation des cellules isolées (étapes 2 et 3).
2. Caractérisation des cellules isolées à l’aide de Western Blotting
- Ajouter 50-100 µL de lyse tampon à chaque passage en suivant les étapes de l’expansion pour caractériser les cellules isolées. Collecter les protéines d’environ 500 000 ou plusieurs cellules.
- Pipette de haut en bas vigoureusement pour rompre les cellules et libérer les protéines. Recueillir et transmettre la mémoire tampon dans un tube de microcentrifuge.
- Tourner le tube de microcentrifuge à 500 x g et transvaser avec soin le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Étiqueter et stocker les tubes à-80 ° C pour le stockage à long terme.
- Quantifier la quantité de protéines dans chaque tube en utilisant soit Bradford ' s ou BCA assay 27 , 28 , 29.
- Réaliser de Western Blot à l’aide de procédures standard 27 , 28 , 29. Analyser 5 µg de protéines totales pour l’expression de CD31, CD34, VEGFR2 et α-SMA. Utiliser des α-tubuline pour normaliser les données.
3. Immunofluorescence indirecte
- soniquer verre 18 mm lamelles dans 50 % d’éthanol et séchez-les. Laissez les lamelles couvre-objet propre dans la plaque de 12 puits du jour au lendemain dans la hotte de sécurité biologique avec un UV lumière pour stériliser les.
- Enrober les lamelles couvre-objet avec 50 & #181 ; g/mL de rat j’ai tail collagène et la plaque de transfert à un 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur pour au moins 60 min.
- Aspirer le collagène et ajouter 1 mL de PBS 1 x à la plaque de 12 puits pour laver les lamelles couvre-objet. Aspirer la solution de PBS 1 x et répéter deux fois.
- Graine 250 000 cultivées EPCs dans chaque puits et les replacer dans les 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur pendant au moins 3 jours avant d’effectuer d’immunomarquage.
- Laver la plaque 3 fois avec du PBS 1 x. Ajouter 1 mL de méthanol glacée à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 15 min fixer les cellules.
- Mener d’immunomarquage à l’aide d’un protocole standard 27 , 28 , 29. Utiliser les anticorps à leurs dilutions appropriées (p. ex., CD31 (01:20), CD34 (01:50), α-SMA (1/100) et VEGFR2 (01:50)).
- Prendre des images de l’immunomarquage lamelles couvre-objet à l’aide d’un microscope à épifluorescence.
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Representative Results
Isolement et l’Expansion des cellules progénitrices endothéliales :
Un schéma (Figure 1) est fourni en décrivant le protocole global. Les couches de composants sanguins différents ont été observés après centrifugation en gradient de densité du sang de cordon ombilical humain avec milieu de gradient de densité. Après ensemencement MNCs sur les plaques imprégnées sur le collagène, l’excroissance des colonies fut observée entre 5 jours et 7 (Figure 2A). Ces colonies ont continué de croître et avaient une morphologie de cellules fusiformes (Figure 2A-2D) dans les premiers stades, qui plus tard ont progressé à une morphologie pavées (Figure 2E-2F). Figure 3 A montre le nombre total de cellules en fonction du temps dans la culture, et chaque point de données représente le nombre cumulé de cellules prélevées à chaque passage. Figure 3 B représente le temps moyen nécessaire pour la première colonie à se poser dans la plaque de 6 puits imprégnées de collagène après l’ensemencement les PTM.
Caractérisation à l’aide de Western Blot :
Figure 4 A montre le représentant résultats du Western blot membrane qui a été testée contre les anticorps différents. Nos résultats suggèrent que les cellules étaient positifs pour CD31 et CD34. L’expression du CD31 (Figure 4B) et CD34 (Figure 4C) semblent diminuer au fil des passages ultérieurs, alors que VEGFR2 (Figure 4D) s’exprime également dans des passages plus tard, avec le premier passage ayant une expression plus élevée. Nous avons également observé que le CPE n’a pas exprimé le marqueur des cellules mésenchymateuses α-SMA (Figure 4E). Les cellules endothéliales (HUVEC) la veine ombilicale humaine et lysats de cellules interstitielles valvulaire (VIC) ont été utilisés comme témoins positifs et négatifs, respectivement. HUVECs sont censés exprimer CD31, CD34 et VEGFR2, tandis que VICs expriment α-SMA.
Figure 1 : Schématique d’isolement CBE. Démarrer l’isolement par cordon diluant de sang avec HBSS et il superposant soigneusement sur le dessus du milieu de gradient de densité, tel qu’illustré. Centrifugation en gradient de densité du sang en couches est effectuée afin d’obtenir des couches distinctes du sang, qui regroupe des multinationales (couche leuco-plaquettaire), milieu de gradient de densité, granulocytes et les globules rouges. L’image de sous-ensemble fournie montre ces différentes couches. Multinationales sont recueillies et redéfinies sur une plaque de culture de cellules imprégnées de collagène. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Progression de la colonie cellulaire. (A.-e.) Images représentatives de lumineux-zone de progression colonie CBE au fil du temps. Notez que la colonie n’a cellules fusiformes aux premiers stades, adoptant la morphologie pavées. (E) l’image représentative de la CBE, cultivé dans un ballon jaugé de T-75 au passage 3. Echelle = 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Des courbes de croissance de l’EPCs. (A) le graphique indique le nombre de cellules qui croissent sur une période de temps, et chacun le point de données désigne la cellule numéro récolté au cours de chaque passage (P0 - P10) (n = 4). (B) temps nécessaire pour que la première colonie de CBE à apparaître dans la plaque de 6 puits (n = 4). Les barres d’erreur indiquent l’erreur-type de la moyenne (SEM). Aucune signification statistique a été trouvée à l’aide d’ANOVA à. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Éponger occidental. (A) la tache occidentale membrane coloré avec les anticorps différents. HUVEC lysat et VIC lysat étaient utilisés comme témoins positifs. (B) l’intensité moyenne des bandes CD31 normalisé avec α-tubuline. (C) l’intensité moyenne des bandes CD34 normalisé avec α-tubuline. (D) l’intensité moyenne des bandes VEGFR2 normalisé avec α-tubuline. (E) moyenne intensité des bandes de α-SMA normalisé avec α-tubuline (n = 3-6). Les barres d’erreur indiquent le SEM. Aucune signification statistique a été trouvée à l’aide d’ANOVA à. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Immunostaining. Images représentatives de l’EPCs cultivés en EGM pendant 7 jours et immunomarquage à divers passages CD31, CD34, VEGFR2 et α-SMA. Balance bar - 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : Le graphique indique le nombre de cellules par unité de surface sur une période de 7 jours lorsqu’il est cultivé en EGM et EBM DMEM. EGM ont montré la croissance cellulaire plus élevée comparée à celle des médias (EBM et DMEM). Les données ont montré une signification statistique, avec p < 0,01, à l’aide d’ANOVA à (n = 2). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
/ > Supplémentaire Figure 2 : des images représentatives de l’EPCs cultivés dans EBM pendant 7 jours et immunomarquage CD31, CD34, VEGFR2 et α-SMA. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 3 : Images représentatives de l’EPCs cultivées en DMEM pendant 7 jours et immunomarquage CD31, CD34, VEGFR2 et α-SMA. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Comme mentionné précédemment, adhérent EPCs possèdent une morphologie pavées. Nos multinationales isolés a progressé d’une colonie de cellules fusiformes (Figure 2A-2D) dans les premiers stades à une colonie de pavées (Figure 2E-2F) sur une période de dix jours de culture. CPE ont été étiquetés différemment par les différents groupes de recherche, à savoir comme fin de cellules progénitrices endothéliales10, colonie endothélial formant des cellules5, ou de cellules progénitrices endothéliales12. Il est à noter que ces cellules sont fonctionnellement identiques et expriment des marqueurs de surface de cellules semblables. Le nombre de cellules observées au cours de la période de culture (Figure 3) a augmenté à presque 108 cellules, analogues aux publications antérieures et typiques le haut potentiel prolifératif EPCs3,5. En effet, il a été constaté que EPCs provenant de sang de cordon ombilical humain ont montré une forte proliférative potentiels et a démontré plusieurs population doublements avant de subir la sénescence comparée à EPCs isolées du sang périphérique humain adulte5 , 10.
Nos résultats Western Blot (Figure 4A) a révélé la présence de CD31, CD34 et VEGFR2 sur des lysats de cellules obtenues EPCs comparées au témoin positif, HUVEC. HUVECs expriment CD31, CD34 et VEGFR2 et activé VIC express α-sSMA. Similaire à précédents rapports10,18, l’expression de CD31 a diminué avec des passages supérieurs. Le modèle d’expression était également semblable dans le cas de CD34 et VEGFR2, où les deux marqueurs ont été exprimées fortement dans le premier passage et en quantités relativement plus faibles mais égales dans les passages plus tard. Ces données montrent une tendance qui est en accord avec les résultats des groupes précédents, dans lequel les protocoles basés sur immunosorting ont été utilisés pour isoler EPCs dérivés du sang cordon12. Généralement, les EPCs n’expriment pas de marqueurs mésenchymateux et, pour vérifier que les cellules isolées n’étaient pas mésenchymateuses dans la nature, nous immunomarquées nos membranes de Western blot avec α-SMA. Nos résultats montrent clairement qu’il n’existait aucune manifestation de α-SMA à l’EPCs cultivés comparativement au témoin positif lysats de cellules prélevés VICs, qui montrent la forte expression d’anticorps α-SMA.
Pour démontrer que EGM permet la prolifération cellulaire accrue par rapport aux autre milieux de culture utilisé pour EPCs, nous cultivé les cellules dans trois différents types de médias : DMEM, EBM et EGM (c.-à-d., EBM additionné de facteurs de croissance, comme indiqué précédemment). Tous ont été additionnés de 10 % FBS. Nous avons semé les cellules des différents passages dans chaque puits d’une plaque de 12 puits. Supplemental Figure 1 montre le nombre de cellules par unité de surface dans chaque puits au fil du temps dans la culture dans les formulations de différents médias. Nous notons que l’EPCs cultivées en EGM ont montré une augmentation régulière de nombre de cellules et pour les cellules de l’EBM, il y avait un rythme plus lent d’augmentation dans le nombre de cellules pendant les trois premiers jours, ce qui par la suite atteint un plateau. Ceci suggère que le CPE pourrait encore survivre dans EBM, mais l’absence de facteurs de croissance entravée de prolifération. Nous notons également que EPCs cultivées en déclin DMEM en nombre, ce qui suggère que cette formulation moyenne particulier n’est pas adaptée pour leur survie ou prolifération. Nos données immunostaining indiquent que l’EPCs cultivées en EGM (Figure 5) CD31 plus par rapport à l’EPCs cultivées dans EBM (la Figure 2) et DMEM (Supplemental Figure 3). Si l'on compare la Figure 5 avec 2 Figure supplémentaire et complémentaire Figure 3, on voit que les cellules n’étaient pas contaminées et d’autres types de cellules. Aussi, lorsque l'on compare l’immunomarquage EPCs (Figure 5), nous pouvons qualitativement affirmer que l’expression de CD31 et CD34 diminué au cours de passages supérieurs, soutenir nos données de Western blot (Figure 4).
Je le répète, l’objectif principal de notre proposition de protocole est de démontrer que l'on peut isoler les cellules progénitrices endothéliales en culture sang multinationales dans des milieux sélectifs spécialisés. Il s’agit de montrer que les EPCs peuvent être isolés sans équipement sophistiqué et des procédures, à la différence des autres méthodes qui impliquent l’utilisation de la cytométrie - soit immédiatement après la RNM isolement1,3,20 , 30 ou après que les colonies sont devenus une monocouche - suivie peuvent4,10,12,13,23. Les colonies de CBE apparaissent généralement entre 5 et 9 jours. Notre méthode est donc une méthode plus rapide et plus efficace pour isoler EPCs. La principale limite de cette technique est que l’expression de CD31 et CD34 diminue avec des passages ultérieurs, ce qui pourraient suggérer que les cellules perdent leur phénotype géniteur. Ainsi, il est recommandé que l'on doit utiliser des cellules obtenues à partir de passage 5 ou inférieur à conduire des expériences si utilisant ce protocole.
Précautions doivent être prises après la centrifugation de densité ne pas déranger les différentes couches lorsque reprenant les tubes centrifugés dans la hotte et aussi lors du retrait du plasma. Une autre étape critique se rapporte à la lyse des érythrocytes, où un temps d’incubation plus longs pourrait potentiellement endommager le RNM. Il est donc recommandé de ne pas répéter cette étape deux fois plus élevé. En effet, puisque l’aspiration moyenne se faite 24h après l’ensemencement, traces des érythrocytes sont supprimés, car ils sont non adhérents. Les substrats alternatifs, comme la fibronectine ou gélatine, tandis que ne pas testé par nos soins, permet également selon des protocoles spécifiques pour créer des revêtements de culture cellulaire. En employant une modification mineure dans les étapes initiales, les chercheurs peuvent isoler non adhérents EPCs30.
En conclusion, nous avons rapporté une méthode d’isoler l’EPCs de sang de cordon ombilical. Il est important de noter que le CPE n’exprime pas les marqueurs comme α-SMA, suggérant qu’ils ne sont pas des cellules mésenchymateuses. En effet, α-SMA sert un marqueur important en essayant d’étudier la transition endothéliales-mésenchymateuse (endo-MT), du CPE. Endo-MT est un processus cellulaire transdifférenciation au cours de laquelle les cellules endothéliales sont connus à perdre leurs marqueurs spécifiques et à se transformer en un phénotype de cellules mésenchymateuses. Il a été démontré que les EPCs peuvent subir cette transition en présence de transformer la croissance factor-β7 et peuvent libérer des protéines de la membrane extracellulaire sur leurs échafaudages tissulaire8. Toutes ces observations indiquent la promesse d’EPCs devant servir comme une source de cellules autologues pour créer une valve cardiaque ou autres constructions tissulaire cardiovasculaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation sous le Grant No. CMMI-1452943 et par le Collège d’honneurs de l’Université de l’Arkansas. Nous tenons également à remercier la Banque de sang de cordon de l’Arkansas pour nous fournir des unités de sang de cordon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A) For isolation and culturing | |||
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | This product comes with all the growth factors needed to make the Endothelial Growth Medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermofisher Scientific | 26140079 | |
| Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Ficoll-Paque | GE Heatlhcare | 17-1440-02 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Thermofisher Scientific | 14170-112 | |
| Ammonium Chloride | Stem Cell Technologies | 7850 | |
| 1x Phosphate Buffer Saline | Thermofisher Scientific | 14190250 | |
| Rat Tail I Collagen | Corning | 354236 | |
| Glacial Acetic Acid | Amresco | 0714-500ML | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| HEPES buffer | Thermofisher Scientific | 15630080 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Thermofisher Scientific | 10566-016 | |
| B) Antibodies and cell lysates | |||
| CD31 | Abcam | ab28364 | 1:250 dilution for Western blotting |
| CD34 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7045 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-SMA | abcam | ab5694 | 1:100 dilution for Western blotting |
| α-tubulin | abcam | ab7291 | 1:2,500 dilution for Western blotting |
| VEGFR2 | abcam | sc504 | 1:100 dilution for Western blotting |
| Human umbilical vein endothelial cell lysate | Santa Cruz Biotechnology | sc24709 | |
| Valve interstitial cell lysate | Primary cell line cultured from own lab and lysed with RIPA buffer | ||
| C) Western blotting and immunostaining | |||
| 10x Tris/Glycine/SDS buffer | Biorad | 161-0772 | Used as running buffer |
| 10x Tris/Glycine buffer | Biorad | 161-0771 | Used as transfer buffer |
| Immobilon-FL transfer membrane | Merck Millipore | IPFL0010 | This is a PVDF transfer membrane that has 45 µm pore size and is mentioned in the protocol as western blot membrane |
| 4x Laemmli sample buffer | Biorad | 161-0747 | |
| 2-mercaptoethanol | Biorad | 161-0710 | |
| 10% Criterion TGX precast gel | Biorad | 5671033 | |
| Prolong Gold antifade | Thermofisher Scientific | P36930 | Used for mounting immunostained coverslips for long term storage |
| Methanol | VWR Analytical | BDH1135-4LP |
References
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