إعادة البناء ثلاثي الأبعاد بنية الأوعية الدموية المبيض الماوس مسح الوضوح السلبي
Summary
نقدم هنا لتكيف من الوضوح السلبي وأسلوب إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للتصور المفرج المبيض وجرابي الشعيرات الدموية في المبايض سليمة الماوس.
Abstract
المبيض هو الجهاز الرئيسي للجهاز التناسلي الإناث، وهو أمر أساسي لإنتاج الأمشاج الإناث ومراقبة النظام الغدد الصماء، ولكن العلاقات الهيكلية المعقدة وأبنية المفرج ثلاثي الأبعاد (3D) المبيض ليست وصفاً جيدا. من أجل تصور اتصالات ثلاثية الأبعاد والهندسة المعمارية من الأوعية الدموية في المبيض سليمة، الخطوة الهامة الأولى جعل المبيض واضح بصريا. تفاديا لانكماش الأنسجة، استخدمنا المائية الوضوح السلبي القائم على التثبيت (مسح الدهن-وتبادل جامدة تهجين الاكريلاميد “المائية الأنسجة” التصوير/إيمونوستينينج/في الموقع-التهجين-متوافق مع) البروتوكول طريقة لمسح مبيض سليمة . ثم استخدمت Immunostaining ومتقدمة مولتيفوتون المجهري [كنفوكل]، والصورة ثلاثية الأبعاد-عمليات إعادة البناء للتصور من سفن المبيض وجرابي الشعيرات الدموية. باستخدام هذا النهج، واظهرنا ارتباط إيجابي كبير (ف < 0.01) بين طول الشعيرات الدموية جرابي وحجم الجدار الحبيبي.
Introduction
المسام هي الوحدة الأساسية الهيكلية والوظيفية المبيض، وتطويره عالية تتصل المفرج داخل المبيض. توفير التغذية والهرمونات للمسام الأوعية الدموية وهكذا تلعب أدواراً هامة في نمو ونضج المسام1.
مزيج من التكنولوجيات، بما في ذلك علامات الأوعية الدموية انتقائية ونماذج الماوس المعدلة وراثيا وتطوير الأدوية، ازدادت معرفتنا حول المبيض شبكات الأوعية الدموية والأوعية، ووظيفة الأوعية الدموية في فوليكولوجينيسيس. ومن المعروف المبيض جهازا نشطاً نظراً لأنه يعيد تشكيل مختلف شبكات الأوعية الدموية والأنسجة أثناء فوليكولوجينيسيس والاباضه. هذا يعيد البناء النشطة في حجم وهيكل السفن المطلوب للوظيفة البيولوجية لتطوير وتوظيف المسام.
الأساليب التقليدية في غذائها وهيستومورفوميتريك باستخدام المقاطع المبيض وإيمونولابيلينج من الأوعية الدموية تقتصر على صور ثنائية الأبعاد (2D)2. مع تطوير تكنولوجيات إعادة الإعمار (3D) ثلاثي الأبعاد، يمكن أن تتداخل الصور 2D لشرائح الأنسجة جعل هيكل ثلاثي الأبعاد، ولكن هذا الأسلوب لا يزال لديها بعض القيود – تقطيع الأنسجة يمكن أن تدمر المجهرية، بعض أجزاء الأنسجة غالباً ما تكون مفقودة، وعمالة كبيرة وتشارك في إجراء عمليات إعادة البناء ثلاثي الأبعاد من الصور التي تم الحصول عليها من الشرائح. كل الأنسجة التصوير ثلاثي الأبعاد مع الفحص المجهري [كنفوكل] يمكن التغلب على كثير من هذه القيود، ولكن هذه الأساليب محدودة في تقييم الأوعية في المبيض الجنينية3. يمكن استخدام أنسجة كله تطهير الطرق مثل الوضوح4 زيادة حجم تصور لحل هذه المشاكل في المبيضين بعد الولادة والكبار، ومثل هذه الأساليب تقديم موافقة الضوئية المبيض دون أي تشوهات هيكلية. تصوير بنية ثلاثية الأبعاد من المبيض سليمة توفر قاعدة بيانات صورة دقيقة للبرنامج تحليل الصور، مثل مجموعة إيماريس من البرامج المستخدمة في هذا العمل.
إعادة عرض المبيض طوال مرحلة البلوغ جزء من نظام ديناميكي الفسيولوجية، وهذا يجعل المبيض نموذجا ممتازا لإجراء تحقيقات في تنظيم الأوعية. وعلاوة على ذلك، يمكن دراسة تقييم دور المبيض الأوعية الدموية في ظروف مرضية من الجهاز التناسلي الإناث مثل متلازمة تكيس المبيض أو سرطان المبيض عن طريق تصوير أنسجة المبيض كله. تطوير أسلوب الوضوح السلبي واستعمال برمجيات تحليل الصور المتقدمة قدمت المعلومات المكانية المفصلة عن العلاقات بين هياكل المبيض مثل المسام والأوعية الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الدراسة الحالية، ونحن نقدم 3D التصوير لتقييم العلاقات بين الشعيرات الدموية والمسام تنامي الفردية. في أعمالنا السابقة باستخدام البروتوكول نفسه 9، قمنا بدراسة أدوار المفرج الكبيرة، والتفاعلات بين المسام، وموقع المسام في المبايض سليمة الماوس. النهج الوضوح السلبي الذي سمح لن…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من “الصندوق الخاص الصيني” عن Postdocs (رقم 2014T70392 إلى يلافن)، مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 81673766 إلى يلافن) والصندوق فتيلة المعلم الجديد، زوزو مؤسسة جامعة فودان، وتطوير المشروع الذروة شانغهاي التكاملية تخصصات الطب (20150407).
Materials
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
Referências
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 – 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
