Трехмерная реконструкция сосудистой архитектуры пассивной очистили ЯСНОСТИ мыши яичника
Summary
Здесь мы представляем адаптация пассивной ЯСНОСТИ и 3D реконструкции метод для визуализации яичников сосудистую и фолликулярной капилляров в яичниках нетронутыми мыши.
Abstract
Яичник является главным органом женской репродуктивной системы и имеет важное значение для производства женских гамет и эндокринной системы, но сложных структурных отношений и трехмерные (3D) сосудистую архитектуры управления яичник не хорошо описаны. Для того, чтобы визуализировать 3D соединения и архитектуры кровеносных сосудов в яичнике нетронутыми, первый важный шаг, чтобы оптически ясно яичника. Для того, чтобы избежать усадки ткани, мы использовали гидрогеля на основе фиксации пассивной ЯСНОСТИ (очистить липидный обмен гибридизированных акриламида грузовик изображений / иммуноокрашивания/в situ гибридизация совместимых тканей гидрогеля) протокола метод для очистки нетронутыми яичника . Иммуноокрашивания, расширенный multiphoton confocal микроскопии и 3D изображение реконструкций затем были использованы для визуализации яичников сосудов и фолликулярной капилляров. Используя этот подход, мы показали значительное положительная корреляция (P < 0.01) между длиной фолликулярной капилляров и объем фолликулярной стены.
Introduction
Фолликул является блок основных структурных и функциональных яичников, и ее развития весьма связано с сосудистую внутри яичника. Кровеносные сосуды поставки питания и гормоны фолликулов и таким образом играют важную роль в обеспечении роста и созревания фолликулов1.
Сочетание технологий, в том числе селективного кровеносный сосуд маркеров, трансгенные мыши модели и фармацевтических разработок, увеличили наши знания о яичников сосудистой сети, ангиогенез и функции кровеносных сосудов фолликулогенез. Завязь известен как активный орган, потому что она моделирует различные ткани и сосудистой сети во время фолликулогенез и овуляции. Такие активные реконструкции в размер и структура судов требуется для биологической функции разработки и набором фолликулов.
Традиционные гистологические и histomorphometric методы, с помощью яичников секций и immunolabeling кровеносных сосудов, ограничиваются двухмерные (2D) изображения2. С развитием технологий трехмерного (3D) реконструкции, 2D изображения срезов ткани могут перекрываться сделать 3D структура, но этот метод все еще имеет некоторые ограничения — секционирование ткани может уничтожить микроструктур, некоторые части ткани часто отсутствуют, и значительный труд участвует в принятии 3D реконструкций из изображений, полученных из кусочков. Целом ткани 3D визуализации с помощью конфокальной микроскопии можно преодолеть многие из этих ограничений, но эти методы ограничены к оценке ангиогенеза в эмбриональных яичников3. Использование цельной ткани, очистка методы, такие как ясность4 может увеличить визуализированных объем с тем, чтобы решить эти проблемы в послеродовой период и взрослых яичников, и такие методы предоставляют оптических Распродажа завязи без каких-либо структурных деформаций. Визуализация 3D архитектуры нетронутыми завязи обеспечивает точный образ базы данных для программного обеспечения для анализа изображений, такие как пакет программного обеспечения Imaris, используемый в этой работе.
Ремоделирование завязи всей взрослой жизни является частью динамической физиологические системы, и это делает завязи отличную модель для расследования положения по ангиогенез. Кроме того оценки роли яичников кровеносных сосудов в патологических условиях женской репродуктивной системы, такие как синдром поликистозных яичников или яичников могут быть изучены через весь яичников ткани изображений. Развитие метода пассивной ЯСНОСТИ и использование программного обеспечения для анализа современных изображений предоставили подробной пространственной информации на отношения между кровеносных сосудов и яичников структур, таких как фолликулов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В текущем исследовании мы представляем 3D визуализации для оценки взаимосвязи между капилляров и отдельных растущих фолликулов. В нашей предыдущей работы, используя же протокол 9мы изучили роль крупных сосудистую, взаимодействия между фолликулов и расположение фолликуло?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантов из китайского Специального фонда для постдокторантов (№ 2014T70392 до YF), Фонд национального естественных наук Китая (№ 81673766 до YF), новый учитель грунтовка фонд, Zuoxue фонд университета Фудань и развитие Проект пик Шанхай дисциплин интегративной медицины (20150407).
Materials
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
Referências
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 – 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
