Reconstrução tridimensional da arquitetura Vascular do ovário passiva Mouse clareza-limpo
Summary
Aqui apresentamos uma adaptação do método de reconstrução 3D para visualização da vasculatura do ovário e capilares foliculares e clareza passiva em ovários intactos do mouse.
Abstract
O ovário é o principal órgão do sistema reprodutor feminino e é essencial para a produção de gametas femininas e para controlar o sistema endócrino, mas as relações estruturais complexas e arquiteturas tridimensionais (3D) vasculatura do ovário não são bem descritas. Para visualizar as conexões 3D e arquitetura dos vasos sanguíneos no ovário intacto, o primeiro passo importante é tornar o ovário opticamente claro. Para evitar o encolhimento do tecido, usamos o hidrogel baseado em fixação passiva CLARITY (lipídios claro-trocadas rígida do acrilamido-hibridizado imagem / Immunostaining/In situ da hibridação-compatível com hidrogel de tecido) método para limpar um ovário intacto de protocolo . Immunostaining, avançado do multiphoton microscopia confocal e imagem-reconstruções 3D foram então usados para a visualização dos vasos ovarianos e capilares foliculares. Usando essa abordagem, mostrou uma correlação positiva significativa (P < 0,01) entre o comprimento dos capilares foliculares e volume da parede folicular.
Introduction
O folículo é a unidade estrutural e funcional fundamental do ovário, e seu desenvolvimento está altamente relacionada com a vasculatura dentro do ovário. Vasos sanguíneos fornecer nutrição e hormônios para os folículos e, portanto, desempenhar um papel importante no crescimento e maturação dos folículos1.
Uma combinação de tecnologias, incluindo marcadores seletiva dos vasos sanguíneos, modelos do rato transgénico e desenvolvimento farmacêutico, aumentaram nosso conhecimento sobre redes vasculares no ovário, angiogênese e a função dos vasos sanguíneos Foliculogénese. O ovário é conhecido como um órgão ativo porque ele remodela vários tecidos e redes vasculares durante Foliculogénese e ovulação. Tal ativo remodela o tamanho e a estrutura dos vasos é necessária para a função biológica de desenvolvimento e de recrutamento de folículos.
Métodos tradicionais de histológica e histomorfométrica usando seções no ovário e immunolabeling dos vasos sanguíneos estão limitados a imagens bidimensionais (2D)2. Com o desenvolvimento de tecnologias de reconstrução tridimensional (3D), imagens em 2D de fatias de tecido podem ser sobrepostas para fazer uma estrutura 3D, mas esse método ainda tem algumas limitações — corte do tecido pode destruir as microestruturas, algumas partes do tecido são muitas vezes ausentes, e significativo trabalho está envolvido em fazer reconstruções 3D a partir de imagens obtidas de fatias. Imagem 3D todo-tecido com microscopia confocal pode ultrapassar muitas dessas limitações, mas esses métodos limitam-se à avaliação da angiogênese no ovário embrionário3. Usar o tecido inteiro limpando métodos tais como clareza4 pode aumentar o volume visualizado a fim de resolver estes problemas nos ovários pós-natal e adultos, e tais métodos fornecem acesso óptico do ovário sem deformações estruturais. Imagem da arquitetura 3D do ovário intacto fornece um banco de dados de imagem exata para software de análise de imagem, tais como o pacote de software hottie utilizado neste trabalho.
Remodelação do ovário durante a vida adulta é parte de um sistema fisiológico dinâmico, e isso faz com que o ovário um excelente modelo para investigações sobre a regulação da angiogênese. Além disso, avaliar o papel de vasos ovarianos em condições patológicas do sistema reprodutor feminino, tais como a síndrome do ovário policístico ou cancros ovarianos pode ser estudada através da imagem do tecido ovariano toda. O desenvolvimento do método passivo clareza e o uso de software de análise avançada de imagens apresentaram informações espaciais detalhadas sobre as relações entre os vasos sanguíneos e ovário estruturas tais como folículos.
Protocol
Representative Results
Discussion
No estudo atual, apresentamos a imagem para avaliar as relações entre os capilares e folículos de crescimento individuais 3D. Em nosso trabalho anterior, usando o mesmo protocolo n º 9, estudamos os papéis de grande vascularização, interações entre os folículos e a localização de folículos nos ovários intactos do mouse. A abordagem passiva de clareza nos permitiu estudar macro e micro –vasculatures, Foliculogénese e as inter-relações entre o alaranjado e folículos, bem como para…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado por subvenções do fundo especial chinesa para pós-docs (n º 2014T70392 de YF), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n º 81673766 de YF), o novo fundo de escorva de professor, a Fundação de Zuoxue da Universidade de Fudan e o desenvolvimento Projeto de Shanghai pico medicina integrativa-disciplinas (20150407).
Materials
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
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