Pasif AÇIKLIĞI temizlenmiş Mouse ovarium vasküler mimarisinin üç boyutlu yeniden yapılandırma
Summary
Burada olduğu gibi fare yumurtalıklarda bir uyum pasif NETLİK ve 3D yeniden yapılanma yöntemi yumurtalık damarlara ve foliküler kılcal görselleştirme için mevcut.
Abstract
Yumurtalık kadın üreme sisteminin ana organ ve kadın gamet üretim için ve endokrin sistem, karmaşık yapısal ilişkiler ve üç boyutlu (3D) damarlara mimarileri, ama kontrol etmek için önemlidir Yumurtalık de açıklanan değildir. 3D bağlantıları ve bozulmamış yumurtalık kan damarlarının mimarisini görselleştirmek için ilk önemli adım yumurtalık optik açık hale getirmektir. Doku büzülme önlemek amacıyla, biz hidrojel kullanılan pasif NETLİK fiksasyon tabanlı (Akrilamid melezleşmiştir Rigid temizleyin Lipid değiş tokuş görüntüleme / Immunostaining/In situ hibridizasyon-uyumlu doku hidrojel) protokol yöntemi sağlam bir yumurtalık temizlemek için . Immunostaining, Gelişmiş multiphoton confocal mikroskobu ve 3D görüntü rekonstrüksiyonu yumurtalık damarlarının ve foliküler kılcal görselleştirme için kullanılmıştır. Bu yaklaşımı kullanarak, önemli bir pozitif korelasyon gösterdi (P < 0,01) foliküler kılcal damarlar ve foliküler duvar hacmi uzunluğu arasında.
Introduction
Folikül temel yapısal ve Fonksiyonel yumurtalık birimidir ve onun gelişme son derece yumurtalık içinde damarlara ilgilidir. Kan damarları beslenme ve hormonlar köklerinin sağlamak ve böylece büyüme ve olgunlaşma köklerinin1önemli rol oynarlar.
Seçici kan damarı işaretleri, transgenik fare modelleri ve ilaç geliştirme teknolojileri kombinasyonu yumurtalık damar ağları, anjiogenez ve kan damarlarının fonksiyonu hakkında bilgimizi artmıştır folliculogenesis. Bu remodels çeşitli doku ve damar ağları folliculogenesis ve yumurtlama sırasında yumurtalık etkin bir organ bilinir. Boyutu ve yapısı damarlarının etkin böyle remodeling geliştirme ve köklerinin işe biyolojik fonksiyonu için gereklidir.
Yumurtalık bölümler ve immunolabeling kan damarlarının kullanarak geleneksel histolojik ve histomorphometric yöntemleri için iki boyutlu (2B) görüntüleri2sınırlıdır. Üç boyutlu (3D) imar teknolojilerinin gelişmesiyle birlikte, dokusu dilimlerin 2D görüntüleri 3D bir yapı yapmak için örtüşen, ancak bu yöntem, hala bazı sınırlamalar vardır — doku kesit microstructures, bazı kısımları yok doku genellikle eksik ve önemli emek dilimleri elde edilen görüntülerden 3B rekonstrüksiyonlar yapımında ilgilenmektedir. Bütün doku 3D görüntüleme confocal mikroskobu ile bu sınırlamaların çoğunu üstesinden gelebilir, ama bu yöntemlerin angiogenez embriyonik Over3değerlendirilmesi ile sınırlıdır. Bütün doku NETLİK4 gibi yöntemleri takas kullanarak doğum sonrası ve yetişkin yumurtalık bu sorunları çözmek için görüntülenmeyecektir birimin artırabilir ve optik izni olmadan herhangi bir yapısal deformasyonlar yumurtalık tür yöntemler sağlar. Sağlam yumurtalık 3D mimari görüntüleme için görüntü analiz yazılımı, bu çalışmada kullanılan Imaris yazılım paketi gibi bir doğru görüntü veritabanı sağlar.
Yumurtalık yetişkinlik boyunca remodeling dinamik bir fizyolojik sistemin ve bu yönetmelik angiogenez soruşturmalar için mükemmel bir model yumurtalık yapar. Ayrıca, polikistik over sendromu veya yumurtalık kanserleri gibi kadın üreme sisteminin patolojik koşullarında yumurtalık kan damarları rolünün değerlendirilmesi tüm yumurtalık dokusu görüntüleme aracılığıyla okudu. Pasif NETLİK yöntem geliştirilmesi ve gelişmiş görüntü analizi yazılımı kullanımı olması koşuluyla detaylı mekansal bilgi kan damarları ve köklerinin gibi yumurtalık yapıları arasındaki ilişkileri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut çalışmada, kılcal damarlar ve bireysel büyüyen köklerinin arasındaki ilişkileri değerlendirmek için görüntüleme 3D tanıtacağız. Önceki çalışmalarda, aynı protokolü 9kullanarak rolleri büyük damarlara, köklerinin ve köklerinin olduğu gibi fare yumurtalık içinde konumunu arasındaki etkileşimler okudu. Pasif NETLİK yaklaşımı mikro ve makro vasculatures, folliculogenesis ve karşılıklı ilişkileri arasında corpora lutea ve köklerinin de yumurtalık mimar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Postdocs için hibe Çin Özel Fonu tarafından desteklenmiştir (YF için No 2014T70392), Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (YF için No 81673766), yeni öğretmen Priming Fonu, Bund’a Üniversitesi Zuoxue temeli ve geliştirme Shanghai en yüksek disiplinleri İntegratif tıp (20150407) projesi.
Materials
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
Referências
- Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
- McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
- Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 – 2), 79-87 (2005).
- Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
- Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810 (2017).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
- Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673 (2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013 (2016).
- Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
- Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
- Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628 (2016).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
- Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895 (2017).
- Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
- Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).
