خطوات الإعداد لقياس مفاعليه في الماوس الشرايين الشبكية السابقين فيفو
Summary
العديد من أمراض العين تهدد الرؤية ترتبط باختلال ميكروفيسيلس الشبكية. ولذلك، من المهم قياس الاستجابات arteriole الشبكية للتحقيق في الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة. توضح هذه المقالة بروتوكول مفصل للماوس arteriole الشبكية العزلة والتحضير لتقييم آثار المواد فعال في الأوعية على قطر الأوعية الدموية.
Abstract
عدم كفاية الأوعية الدموية والتعديلات في نضح الشبكية العادي من بين العوامل الرئيسية لأمراض تهدد البصر العين أمراض مختلفة، مثل اعتلال الشبكية السكري واعتلال الشبكية من ارتفاع ضغط الدم، وربما الزرق. ولذلك، الاستعدادات microvascular الشبكية أدوات المحوري للدراسات الفسيولوجية والدوائية لتحديد الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة، وتصميم علاجات للأمراض. وعلى الرغم من الاستخدام الواسع لنماذج الماوس في أبحاث العيون، دراسات حول مفاعليه الأوعية الدموية الشبكية شحيحة في هذه الأنواع. واحد أسباب رئيسية لهذا التفاوت هو إجراءات العزل صعبة نظراً لصغر حجم هذه الأوعية الدموية الشبكية، و ~ ≤ 30 ميكرومتر في القطر لومينال. للالتفاف على مشكلة العزلة مباشرة من هذه ميكروفيسيلس الشبكية للدراسات الفنية، قمنا بإنشاء أسلوب العزل وإعداد تمكن السابقين فيفو دراسات للماوس فاسواكتيفيتي الشبكية تحت ظروف القرب الفسيولوجية . على الرغم من أن الاستعدادات التجريبية الحالية سوف تشر تحديداً إلى الشرايين الشبكية الماوس، يمكن سهولة استخدام هذه المنهجية ميكروفيسيلس من الفئران.
Introduction
اضطرابات في نضح الشبكية قد تورطت في الآلية المرضية لأمراض العين المختلفة، مثل اعتلال الشبكية السكري وارتفاع ضغط الدم اعتلال الشبكية والزرق1،،من23. وهكذا، دراسات تهدف إلى قياس مفاعليه الأوعية الدموية في شبكية العين هامة لفهم الفسيولوجيا المرضية لهذه الأمراض وتطوير علاج جديد للنهج.
نظراً لإمكانية التلاعب بالجينات في الجينوم مورين، أصبح الماوس نموذج حيوانية مستخدمة على نطاق واسع للدراسات المتعلقة بنظام القلب والأوعية الدموية4. ومع ذلك، بسبب صغر حجم الأوعية الدموية الشبكية (≤ 30 ميكرومتر)، قياس مفاعليه الأوعية الدموية في الشبكية الماوس يمثل تحديا. على سبيل المثال، تقنيات ستيريوميكروسكوبيك للقياس في فيفو محدودة في هذه الدقة البصرية وللسماح فقط للضبط الكشف عن التغييرات في القطر أو الدم تدفق في الدم الصغيرة أقل من القطر 30 ميكرون أو أقل عندما مجهزة أجهزة إضافية متطورة مثل مجهر [كنفوكل] استخدام الأصباغ الفلورية أو5،“فحص منظار الضوء البصريات التكيفية”6. وعلاوة على ذلك، تفسير القياسات في فيفو يهدف إلى تحديد المحلية إشارات يمكن مرتبك الآليات في الأوعية الدموية الشبكية بالتخدير، التغيرات في ضغط الدم النظامية وتأثير الأوعية الدموية خلف المقلة.
ولذلك، قمنا بتطوير طريقة لقياس استجابات الأوعية الدموية الشبكية الماوس مع عالية الدقة البصرية السابقين فيفو. تسمح هذه التقنية المقدمة في هذه الوثيقة التصور للشرايين الشبكية عن طريق إحالة الخفيفة الميكروسكوب. يوفر هذا الأسلوب، التي يمكن أن تستخدم أيضا في الفئران، الوصول إلى مزايا الجينات تستهدف التكنولوجيا في أبحاث الأوعية الدموية العين.
Protocol
Representative Results
Discussion
قياس استجابات الأوعية الدموية في الشبكية الماوس هو التحدي نظراً لصغر حجم الأوعية الدموية الشبكية. مع هذه التقنية المقدمة، هي تصور الشرايين الشبكية بالفحص المجهري الخفيفة المنقولة. هذا ممكن، أنها شفافة الشبكية معزولة. وميزة هذا الأسلوب هو عالية الدقة البصرية. القرار المكانية المحسوب مقص?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل منح من أوند إرنست بيرتا جريمكي Stiftung والألمانية Deutsche أوفثالمولوجيشي (الكلب).
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
Referências
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
