שלבי הכנה מדידה של תגובתיות ב העכבר רבים ברשתית Vivo לשעבר
Summary
מחלות רבות סכנת חזון עינית משויכות לקוי microvessels ברשתית. לכן, המדידה של תגובות arteriole ברשתית הוא חשוב לחקור את המנגנונים הקשורים pathophysiological המשמש כבסיס. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור בידוד arteriole רשתית העכבר והכנות כדי להעריך את ההשפעות של חומרים vasoactive על קוטר כלי הדם.
Abstract
. אי ספיקת שינויים זלוף ברשתית נורמלי הם בין הגורמים העיקריים בפתוגנזה של סכנת הראייה עינית מחלות שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית, רטינופתיה יתר לחץ דם, ואולי גלאוקומה. לכן, ההכנות microvascular ברשתית הם כלים מרכזי עבור מחקרים פיזיולוגיים תרופתי על המנגנונים הקשורים pathophysiological כבסיס לעיצוב טיפולים עבור המחלות. למרות השימוש בעכבר מודלים במחקר אופטלמולוגיות רחב, מחקרים על תגובתיות כלי הדם ברשתית נדירים של מין זה. הסיבה הראשית לסתירה הזו היא ההליכים בידוד מאתגר בשל גודלו הקטן של אלו כלי דם ברשתית, אשר ~ ≤ 30 מיקרומטר בקוטר luminal. כדי לעקוף את הבעיה של בידוד ישיר של אלה microvessels ברשתית ללימודי פונקציונלי, הקמנו שיטת בידוד והכנות המאפשרת שמחוץ מחקרים של vasoactivity רשתית העכבר בתנאים ליד-פיזיולוגיים . למרות ההכנות ניסיוני נוכח באופן ספציפי יפנה אל רבים רשתית העכבר, מתודולוגיה זו יכול בקלות להיות מועסק כדי microvessels של חולדות.
Introduction
הפרעות ברשתית זלוף היו מעורבים בפתוגנזה של מחלות עינית שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית, יתר לחץ דם רטינופתיה גלאוקומה1,2,3. לכן, מחקרים שמטרתם מדידה תגובתיות כלי הדם ברשתית חשוב להבין הפתופיזיולוגיה של מחלות אלו, לפתח טיפול חדש מתקרב.
בשל האפשרות של מניפולציה ג’ין הגנום מאתר, העכבר הפך מודל בעלי חיים בשימוש נרחב למחקרים של מערכת הלב וכלי דם4. עם זאת, בשל גודלו הקטן של כלי הדם ברשתית (≤ 30 מיקרומטר), מדידה של תגובתיות כלי הדם ברשתית העכבר הוא מאתגר. לדוגמה, טכניקות stereomicroscopic ויוו למדידה בו רזולוציה אופטית שלהם מוגבלים, לכן אפשר רק בדיוק לזהות שינויים בזרימת קוטר או דם בדם קטן של פחות מקוטר 30 מיקרומטר ≤ כאשר היא מצוידת נוספים התקנים מתוחכמים, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות צבעי פלורסנט או אופטיקה אדפטיבית סריקה Ophthalmoscope אור5,6. יתר על כן, הפרשנות של ויוו מדידות שמטרתם זיהוי מקומי איתות מנגנונים בכלי הדם ברשתית יכולה להיות מבולבל על ידי הרדמה, משתנה לחץ דם סיסטמי, ההשפעה של כלי הדם retrobulbar.
לכן, פיתחנו שיטה למדידת תגובות של כלי הדם ברשתית עכבר עם רזולוציה אופטית גבוהה ex-vivo. הטכניקה שהוצגו במסמך זה מאפשר הדמיה של רבים ברשתית ויה ששודרו מיקרוסקופ אור. שיטה זו, אשר יכול לשמש גם בחולדות, מספקת גישה היתרונות של גן מיקוד הטכנולוגיה במחקר וסקולרית עינית.
Protocol
Representative Results
Discussion
המדד של תגובות כלי הדם ברשתית העכבר הוא מאתגר בשל גודלו הקטן של כלי הדם ברשתית. עם הטכניקה שהוצגו, רבים ברשתית הם דמיינו ידי מיקרוסקופ אור המשודרת. זה אפשרי, כי הרשתית מבודד הוא שקוף למחצה. היתרון של השיטה הוא אופטי ברזולוציה גבוהה. הרזולוציה המרחבית מחושב הוא px 11/מיקרומטר. אולם, הפתרון האמי?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של ארנסט und ברטה Grimmke Stiftung ואת בווריה Ophthalmologische דויטשה (הכלב).
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
Referências
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
