Шаги подготовки для измерения реактивности в мыши артериол сетчатки Ex Vivo
Summary
Многие видение угрожая глазные заболевания связаны с неблагополучной сетчатки микрососудов. Таким образом измерение артериолы сетчатки ответов имеет важное значение для расследования основные патофизиологические механизмы. Эта статья описывает подробный протокол для мыши артериолы сетчатки изоляции и подготовке для оценки воздействия вазоактивных веществ на сосудистой диаметра.
Abstract
Сосудистая недостаточность и изменения в нормального кровоснабжения сетчатки являются одним из основных факторов патогенеза различных зрение угрожая глазных заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, гипертоническая ретинопатия и, возможно, глаукома. Таким образом сетчатки микрососудистой препараты являются ключевой инструменты для физиологических и фармакологических исследований очертить основные патофизиологические механизмы и дизайн терапии для лечения заболеваний. Несмотря на широкое использование мыши модели в офтальмологических исследований исследования сетчатки сосудистой реактивности не хватает в этой породы. Основной причиной этого несоответствия является сложной процедуры изоляции вследствие небольшого размера этих сетчатки кровеносных сосудов, которая является ~ ≤ 30 мкм в диаметре Люминал. Чтобы обойти эту проблему прямого изоляции этих сетчатки микрососудов для функциональных исследований, мы создали изоляции и подготовка техника, позволяющая ex vivo исследования сетчатки вазоактивных мыши вблизи физиологических условиях . Хотя настоящий экспериментальных препаратов будет специально ссылаются на артериолы сетчатки мыши, эта методология легко могут быть использованы микрососудов от крыс.
Introduction
Беспорядки в сетчатки перфузии замешаны в патогенезе различных глазных заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, гипертонической ретинопатии и глаукома1,2,3. Таким образом исследования, направленные на измерение сосудистой реактивности в сетчатке важно понимать патофизиологию этих заболеваний и разрабатывать новые методы лечения подходов.
Благодаря возможности манипулирования генов в геноме мышиных мышь стала широко используемых животных модели для исследования сердечно-сосудистой системы4. Однако из-за малого размера сетчатки сосудов (≤ 30 мкм), измерение сосудистой реактивности в сетчатке мыши является сложной задачей. Например stereomicroscopic методы для измерения в vivo ограничены в их оптической резолюции и поэтому только позволяют точно определять изменения диаметра или крови поток в малой кровью диаметром ≤ 30 мкм при оснащении с менее Дополнительные сложных устройств, таких как конфокального микроскопа с помощью флуоресцентных красителей или Адаптивная оптика сканирование свет офтальмоскоп5,6. Кроме того толкование в естественных условиях измерений, направленных на выявление местных сигнальные механизмы в сетчатки сосудов может быть confounded с анестетиками, изменения системного артериального давления и влияния ретробульбарная кровеносных сосудов.
Поэтому мы разработали метод измерения реакции мыши сетчатки сосудов с высокой оптической резолюции ex vivo. Техника, представленная в настоящем документе позволяет визуализировать артериол сетчатки через передачи световой микроскопии. Этот метод, который может также использоваться в крыс, обеспечивает доступ к преимущества гена ориентации технологии в глазной сосудистых исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Измерение сосудистых реакций в сетчатке мыши является сложной задачей из-за небольшого размера кровеносных сосудов сетчатки. С представленной техникой артериолы сетчатки визуализируются путем передачи световой микроскопии. Это возможно, потому, что изолированные сетчатки полупрозр…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантов от Эрнст und Berta Grimmke Stiftung и Deutsche Gesellschaft офтальмологические (собака).
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
Referências
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
