Productie van genetisch gemanipuleerde gouden Syrische Hamsters door Pronuclear injectie van het Complex van de CRISPR/Cas9
Summary
Pronuclear (PN) injectie van de geclusterde interspaced regelmatig korte palindromische herhaalt (CRISPR) en CRISPR-geassocieerde proteïne-9 nuclease (CRISPR/Cas9)-systeem is een zeer efficiënte methode voor de productie van genetisch gemanipuleerde gouden Syrische hamsters. Hierin beschrijven we het gedetailleerde PN injectie protocol voor de productie van gene knockout hamsters met het systeem CRISPR/Cas9.
Abstract
De pronuclear (PN) injectietechniek werd opgericht in muizen te introduceren van buitenlandse genetische materiaal in de pronuclei van één-cel fase embryo’s. Het geïntroduceerde genetisch materiaal kan integreren in het embryonaal genoom en genereren van transgene dieren met buitenlandse genetische informatie na overdracht van de geïnjecteerde embryo’s ter bevordering van de moeders. Na het succes in muizen, PN injectie met succes is toegepast in vele andere diersoorten. Onlangs, PN injectie heeft met succes gewerkt om reagentia bij het wijzigen van gen activiteiten, zoals het systeem van de CRISPR/Cas9, boerderij diersoorten te bereiken site-specific genetische modificaties in verschillende laboratorium. Naast het beheersen van de speciale set van microinjection vaardigheden voor de productie van genetisch gemodificeerde dieren door PN injectie, moeten onderzoekers begrijpen de Fysiologie van de voortplanting en het gedrag van de doelsoort, omdat elke soort uniek presenteert uitdagingen. Bijvoorbeeld, gouden Syrische hamster embryo’s hebben unieke behandeling eisen in vitro zodat PN injectie technieken niet mogelijk in deze soort tot recente doorbraken van onze fractie waren. Met onze soorten gemodificeerde PN injectie protocol, is het gelukt in het produceren van verschillende gene knock-out, (KO) en knockin (KI) hamsters, die met succes zijn gebruikt om ziekten van de mens van het model. Hier beschrijven we de PN injectie procedure voor het uitbrengen van de CRISPR/Cas9-complex aan de zygoten van de hamster, het embryo behandeling voorwaarden, embryo transfer procedures en veeteelt nodig voor de productie van genetisch gemodificeerde hamsters.
Introduction
De gouden goudhamster (Mesocricetus auratus) is één van de meest gebruikte knaagdieren voor biomedisch onderzoek. Volgens het Amerikaanse ministerie van landbouw, werden ongeveer 100.000 hamsters gebruikt in de Verenigde Staten in 2015, 13% van totale laboratorium dierlijke gebruik onder de soorten die vallen door de Animal Welfare Act (http://www.aphis.usda.gov; toegankelijk 10 maart, 2017).
De hamster biedt diverse voordelen ten opzichte van andere knaagdieren in de studie van een aantal ziekten bij de mens. Bijvoorbeeld, de alvleesklier ductaal adenocarcinomas histopathologisch onderzoek van N-nitrosobis(2-oxopropyl) amine (BOP) geïnduceerde in hamster is vergelijkbaar met menselijke alvleesklier tumoren, terwijl BOP behandeling voornamelijk induceert tumoren van de schildklier bij ratten en longen en lever tumoren in muizen1. Omdat hamsters het slechts kleine knaagdier gevonden zijn ter ondersteuning van de replicatie van adenovirussen, zijn ze ook het model van de keuze voor het testen van adenovirus gebaseerde oncolytische vectoren en anti-adenovirus drugs2,3,4. Een ander voorbeeld waarin de hamster-model een voordeel ten opzichte van muizen en ratten biedt is in de studie van hyperlipidemie. Mens en hamsters vertonen grote overeenkomsten in lipide stofwisselingsroutes en beide soorten dragen het gen cholesteryl ester transfer proteïne (CETP), die een centrale rol in lipide stofwisseling speelt, terwijl CETP is afwezig in muizen en ratten5codering. Daarnaast ontwikkelen hamsters hemorragische ziekte meer representatief zijn voor de menselijke manifestatie na blootstelling aan Ebola virus6. Hamsters zijn ook de modellen van keuze voor de studie van atherosclerose7, mondelinge carcinomen8en inflammatoire myopathieën9. Onlangs, ook is gebleken dat de hamsters zeer gevoelig voor infectie met een macrovirus Andes zijn en hantavirus syndroom-achtige longziekte ontwikkelen, die het alleen knaagdieren model van Andes virus infectie10.
Om aan te pakken onvervulde behoefte aan nieuwe genetische dierlijke modellen om te bestuderen van de menselijke ziekten waar geen betrouwbare kleine knaagdieren model beschikbaar is, wij onlangs geslaagd bij de toepassing van de CRISPR/Cas9-systeem op de hamster en hebben verscheidene lijnen van genetisch gemanipuleerde hamsters11. Hamster zygoten zijn zeer gevoelig voor milieu milieus, zodanig dat de PN injectie protocollen ontwikkeld in andere soorten ongeschikt zijn. Daarom ontwikkelden we een PN injectie protocol voor de hamster dat geschikt is voor de speciale vereisten voor het afhandelen van de hamster embryo’s in vitro. Hier beschrijven we de gedetailleerde PN injectie procedure met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem en de bijbehorende stappen, van de voorbereiding van enkele gids RNA (sgRNA) voor de overdracht van de geïnjecteerde embryo’s in ontvangende vrouwtjes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om beter de mogelijkheden van gouden Syrische hamsters als modellen van ziekten bij de mens, ontwikkelden we een PN injectie protocol voor het leveren van een CRISPR/Cas9 complex te richten op het genoom van de hamster. Het protocol van de injectie PN optimaliseert verschillende belangrijke variabelen met inbegrip van het embryo kweekmedium, temperatuur en golflengten van licht13. Er zijn ook verschillende hamster-specifieke dierlijke omgang die volgen moeten voor het succesvol uitvoeren van genta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door de nationale instituten van allergie en besmettelijke ziekten (NIAID) van de National Institutes of Health onder het nummer 1R41OD021979 award (tot ZW) en door een onderzoek subsidie van de Next-Generation BioGreen 21 Programma, Republiek Korea, verlenen neen. PJ01107704 (tot ZW) en verlenen geen. PJ01107703 (naar IK). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health of BioGreen 21. Wij danken Dr Nikolas Robl voor het bewerken van het manuscript.
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
Referências
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three–Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
