Produção de geneticamente modificados Hamsters sírios dourados por injeção pró-nuclear do complexo CRISPR/Cas9
Summary
Pró-nuclear injeção (PN) do cluster regularmente intercaladas curtas palíndromos repetições (CRISPR) e sistema CRISPR-associada da proteína-9 nuclease (CRISPR/Cas9) é um método altamente eficiente para produzir hamster sírio dourado geneticamente modificado. Aqui, descrevemos o protocolo de injeção PN detalhado para a produção de hamsters de gene nocaute com o sistema CRISPR/Cas9.
Abstract
A técnica de injeção pró-nuclear (PN) foi criada em ratos para introduzir materiais genéticos estranhos os pró-núcleos do estágio de uma célula. O material genético introduzido pode integrar o genoma embrionário e gerar animais transgénicos com informação genética externa após transferência dos embriões injetados para fomentar as mães. Após o sucesso em camundongos, injeção de PN tem sido aplicada com sucesso em muitas outras espécies animais. Recentemente, injeção de PN tem sido empregada com sucesso para introduzir os reagentes com gene-modificando atividades, tais como o sistema CRISPR/Cas9, para alcançar as modificações genéticas site-specific em laboratório vários e espécies de animais da fazenda. Além de dominar o conjunto especial de habilidades de microinjeção de produzir animais geneticamente modificados pela injeção de PN, pesquisadores devem entender a fisiologia da reprodução e comportamento das espécies-alvo, porque cada espécie apresenta exclusivo desafios. Por exemplo, o hamster sírio dourado embriões têm únicas exigências em vitro de manipulação tal que PN injeção técnicas não foram possíveis nesta espécie até recentes descobertas pelo nosso grupo. Com nosso protocolo de injeção PN espécies modificadas, conseguimos produzir vários nocaute do gene (KO) e batendo os hamsters (KI), que têm sido utilizados com sucesso para doenças humanas de modelo. Aqui descrevemos o procedimento de injeção de PN para entregar o complexo CRISPR/Cas9 zigotos do hamster, condições de manipulação do embrião, os procedimentos de transferência de embriões, e pecuária necessária para produzir geneticamente modificado os hamsters.
Introduction
O hamster sírio dourado (Mesocricetus auratus) é um dos roedores mais amplamente utilizados para a investigação biomédica. De acordo com o departamento de agricultura dos EUA, aproximadamente 100.000 hamsters foram utilizados nos Estados Unidos em 2015, que representam 13% do uso de animais de laboratório total entre as espécies abrangidas pelo acto de bem-estar Animal (http://www.aphis.usda.gov; acessado 10 de março de 2017).
O hamster oferece diversas vantagens sobre outros roedores no estudo de uma série de doenças humanas. Por exemplo, as adenocarcinomas ductal pancreático de histopatologia de amina N-nitrosobis(2-oxopropyl) (BOP) induzida em hamster é semelhante à humanos tumores pancreáticos, enquanto BOP tratamento principalmente induz tumores da glândula tireoide em ratos e pulmão e tumores no fígado em os ratos1. Porque os hamsters são o apenas pequeno roedor encontrado para suportar a replicação de adenovírus, eles também são o modelo de escolha para testes baseados em adenovírus Oncolíticos vetores e drogas antiadenovírus2,3,4. Outro exemplo no qual o modelo de hamster oferece uma vantagem sobre ratos e ratos é no estudo de hiperlipidemia. Os seres humanos e hamsters apresentam grandes semelhanças nas vias metabólicas de lipídios e ambas as espécies carregam o gene que codifica o colesterol éster proteína de transferência (CETP), que desempenha um papel central em lipídios, metabolismo, enquanto CETP é ausente em camundongos e ratos5. Além disso, os hamsters desenvolvem doença hemorrágica mais representativa da manifestação humana após exposição a vírus de Ebola6. Os hamsters são também os modelos de escolha para o estudo da aterosclerose7, carcinomas oral8e miopatias inflamatórias9. Recentemente, também demonstrou que os hamsters são altamente suscetíveis a infecção pelo vírus Andes e desenvolvem a doença, como síndrome pulmonar hantavírus, fornecendo o modelo apenas roedor de Andes vírus infecção10.
Para resolver a necessidade não atendida de novos modelos animais genéticas estudar as doenças humanas onde nenhum modelo de roedor pequeno confiável está disponível, nós recentemente conseguido aplicando o sistema CRISPR/Cas9 para o hamster e produziram várias linhas de geneticamente os hamsters engenharia11. Zigotos de hamster são altamente sensíveis a www.UniEthos.org.br ambiental tal que os protocolos de injeção PN desenvolvidos em outras espécies são inadequados. Portanto, nós desenvolvemos um protocolo de injeção de PN para o hamster que acomoda os requisitos especiais para a manipulação de embriões de hamster em vitro. Aqui, descrevemos o procedimento de injeção de PN detalhado utilizando o sistema CRISPR/Cas9 e as etapas de acompanhamento, desde a preparação do único guia de RNA (sgRNA) para a transferência de embriões injetados em fêmeas de destinatário.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para melhor explorar o potencial de hamsters sírios dourados como modelos de doenças humanas, desenvolvemos um protocolo de injeção de PN para entregar um CRISPR/Cas9 complexo para direcionar o genoma de hamster. O protocolo de injeção PN otimiza diversas variáveis chaves, incluindo o meio de cultura de embrião, temperatura e comprimentos de onda de luz13. Existem também vários procedimentos de manipulação de animais específicos do hamster que precisam seguir para a realização com ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelos institutos nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID) dos institutos nacionais de saúde, sob número 1R41OD021979 de prêmio (para ZW) e por uma bolsa de investigação entre a geração BioGreen 21 Programa, República da Coreia, conceder n. PJ01107704 (para ZW) e conceder n. PJ01107703 (para IK). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health ou BioGreen 21. Agradecemos o Dr. Nikolas Robl para editar o manuscrito.
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
Referências
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K. Chapter three–Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds. Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).
- Thomas, M. A., et al. Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors. Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).
- Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors. Methods Mol Med. , 169-183 (2007).
- Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).
- Ebihara, H., et al. A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).
- Jove, M., et al. Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters. Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).
- Vairaktaris, E., et al. The hamster model of sequential oral oncogenesis. Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).
- Paciello, O., et al. Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies. Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).
- Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome. Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).
- Fan, Z., et al. Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 9 (10), e109755 (2014).
- McKiernan, S. H., Bavister, B. D. Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production. Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).
- Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).
