CRISPR/Cas9 복잡 한 Pronuclear를 주입 하 여 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터의 생산
Summary
클러스터의 pronuclear (PN) 주입은 정기적으로 짧은 구조 반복 (CRISPR) interspaced 그리고 CRISPR 관련 단백질-9 nuclease (CRISPR/Cas9) 시스템은 생산 하는 유전자 조작된 골든 시리아 햄스터는 매우 효율적인 방법. 여기, 우리는 유전자 녹아웃 햄스터 CRISPR/Cas9 시스템의 생산에 대 한 자세한 PN 주입 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
Pronuclear (PN) 주입 기술 1 셀 단계 배아의 pronuclei로 외국 유전 물질을 소개 하는 마우스에 처음 설립 되었다. 소개 유전 물질 배아 게놈으로 통합 하 고 외국 유전 정보 전송 주입된 태아의 어머니를 육성 하기 위해 유전자 변형 동물 생성 수 있습니다. 마우스에 성공, PN 주입 성공적으로 많은 다른 동물 종에 적용 되었습니다. 최근, PN 주입은 성공적으로 고용 되었다 유전자-수정 된 시 약을 소개 활동, 여러 실험실에서 사이트별 유전 수정 하 고 동물 농장을 CRISPR/Cas9 시스템 등. 마스터링 PN 주입 하 여 유전자 변형된 동물을 생산 하기 위해 microinjection 능력의 특별 한 세트, 뿐만 아니라 연구원 이해 해야 한다 재생산 생리학 및 동작의 대상 종 각 종족 고유 때문에 도전입니다. 예를 들어 시리아 황금 햄스터 배아는 독특한 PN 주입 기술을 우리의 그룹에 의해 최근 혁신까지이 종에 불가능 했다 그런 생체 외에서 요구 사항 처리. 우리의 종 수정 PN 주입 프로토콜, 우리는 여러 유전자 녹아웃 (KO)를 생성 하 고 모델 인간의 질병을 성공적으로 사용 되었습니다 (기) 햄스터를 쫓 고에 성공 했다. 여기 우리 햄스터, 배아 처리 조건, 배아 전송 절차, zygotes에 CRISPR/Cas9 복잡 한을 제공 하기 위한 PN 주입 절차를 설명 하 고 농업 유전자를 생산 하는 데 필요한 수정 햄스터.
Introduction
골든 시리아 햄스터 (Mesocricetus auratus) 생물 의학 연구에 대 한 가장 널리 사용 되는 설치류 중 하나입니다. 농업의 미 교육부에 따르면 약 100000 햄스터 동물 복지 행위 (http://www.aphis.usda.gov; 액세스에 의해 보호 종 중 총 실험 동물 사용의 13%, 2015 년에는 미국에서 사용 되었다 3 월 10 일, 2017).
햄스터는 다양 한 인간 질병의 연구에 다른 설치류에 여러 이점을 제공합니다. 예를 들어 햄스터에서 유도 된 N-nitrosobis(2-oxopropyl) 아민 (밥)의 histopathology 췌 장 ductal adenocarcinomas 비슷합니다 인간의 췌 장 종양, 밥 처리는 주로 쥐와 폐에서 갑 상선 종양, 간 종양에 유도 하는 동안 마우스1. 햄스터는 작은 설치류 adenoviruses의 복제를 지원 하기 위해 발견, 때문에 그들은 또한 oncolytic 아 데 노비 루스 기반 벡터 및 안티 아 데 노 바이러스 약2,,34테스트를 위한 선택의 모델. 혈의 연구에 햄스터 모델 쥐 및 쥐에 비해 우위를 제공 하는 점에서 또 다른 예가입니다. 인간과 햄스터 지질 대사 경로에 큰 유사성을 전시 하 고 두 종 인코딩 cholesteryl 에스테 르 이동 단백질 (CETP), 지질 물질 대사, CETP는 쥐에 결 석 하 고5쥐에 중심 역할을 담당 하는 유전자. 또한, 햄스터 출혈 질병 더 에볼라 바이러스6에 노출 다음 인간 형상의 대표적인 개발. 햄스터 아 테 롬7, 구두 carcinomas8및 선 동적인 myopathies9공부에 대 한 선택의 모델도 있습니다. 최근에, 그것은 또한 증명 되었습니다 햄스터 안데스 바이러스 감염에 매우 취약 하 고 hantavirus 폐 증후군 같은 질병, 안데스 바이러스 감염10만 설치류 모델을 개발.
신뢰할 수 없는 작은 설치류 모델을 사용할 수 있는 인간의 질병을 연구 소설 유전 동물 모델에 대 한 unmet 필요를 해결 하기 위해 우리가 최근에 햄스터에 CRISPR/Cas9 시스템 적용에 및 유전자 여러 줄의 생산 햄스터11설계. 햄스터 zygotes는 환경 milieus에 매우 민감한 같은 다른 종에서 개발 된 PN 주입 프로토콜 적합 하지 않습니다. 따라서, 우리는 햄스터 햄스터 배아 시험관을 처리 하기 위한 특별 한 요구를 수용 하는 PN 주입 프로토콜을 개발 했다. 여기, 우리는 CRISPR/Cas9 시스템 및 받는 사람 여성에 주입 된 배아의 전송에 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 준비에서 동반 단계를 사용 하 여 자세한 PN 주입 절차를 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
더 나은 인간 질병의 모델로 시리아 황금 햄스터의 잠재력을 악용, 우리는 CRISPR/Cas9 복잡 한 햄스터 게놈을 대상으로 제공 하기 위한 PN 주입 프로토콜을 개발 했다. PN 주입 프로토콜 배아 배양, 온도 및 빛13의 파장을 포함 하 여 몇 가지 주요 변수를 최적화 합니다. 또한 성공적으로 햄스터에 유전자를 대상으로 실시 하기 위한 따라야 하는 여러 햄스터 관련 동물 처리 절차가 있?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 간행물에 보고 된 연구 알레르기의 국가 학회 및 감염 증 (NIAID) (ZW)을 수상 번호 1R41OD021979에서 건강의 국가 학회에의 하 고 다음-세대 BioGreen 21에서 연구 보조금에 의해 지원 되었다 프로그램, 한국, no를 부여 합니다. PJ01107704 (ZW) 하 고 no를 부여. (익)을 PJ01107703입니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 건강의 국가 학회 또는 BioGreen 21 공식 의견을 대표 하지 않는다. 우리 감사 박사 Nikolas Robl는 원고 편집.
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
Referências
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