Produzione di geneticamente criceti dorati siriani di pronuclei iniezione del complesso CRISPR/Cas9
Summary
Pronuclei iniezione (PN) del cluster regolarmente intervallate brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) e sistema di CRISPR-collegato della proteina-9 nucleasi (CRISPR/Cas9) è un metodo altamente efficiente per produrre geneticamente criceti dorati siriani. Qui, descriviamo il protocollo dettagliato di PN iniezione per la produzione di gene knockout criceti con il sistema CRISPR/Cas9.
Abstract
La tecnica di iniezione pronuclei (PN) è stata fondata in topi per introdurre materiale genetici estraneo in pronuclei di embrioni in fase uno-cella. Materiale genetico introdotto può integrarsi nel genoma embrionale e generare animali transgenici con stranieri informazioni genetiche dopo il trasferimento degli embrioni iniettati per favorire le madri. Dopo il successo nei topi, iniezione di PN è stato applicato con successo in molte altre specie animali. Recentemente, iniezione PN è stato impiegato con successo per introdurre i reagenti con gene-modifica attività, quali il sistema CRISPR/Cas9, per ottenere le modifiche genetiche site-specifiche in laboratorio diversi e specie animali da fattoria. Oltre alla padronanza il set speciale di microiniezione competenze per la produzione di animali geneticamente modificati mediante iniezione di PN, i ricercatori devono capire la fisiologia della riproduzione e il comportamento delle specie bersaglio, perché ogni specie presenta unico sfide. Ad esempio, criceto siriano embrioni hanno unica gestione requisiti in vitro tale che tecniche di iniezione di PN non erano possibili in questa specie fino alle recenti scoperte dal nostro gruppo. Con il nostro protocollo per volta specie iniezione PN, siamo riusciti a produrre diversi knockout del gene (KO) e knockin criceti (KI), che sono stati utilizzati con successo per malattie umane modello. Qui descriviamo la procedura di iniezione di PN per la consegna del complesso CRISPR/Cas9 per gli zigoti del criceto, le condizioni di manipolazione dell’embrione, le procedure di trasferimento dell’embrione, e allevamento necessaria per produrre geneticamente modificati criceti.
Introduction
Criceto siriano dorato (Mesocricetus auratus) è uno dei roditori più ampiamente usati per la ricerca biomedica. Secondo l’US Department of Agriculture, circa 100.000 criceti sono stati usati negli Stati Uniti nel 2015, che rappresentano il 13% di utilizzo degli animali di laboratorio totale tra specie contemplate dall’Animal Welfare Act (http://www.aphis.usda.gov; letta 10 marzo 2017).
Il criceto offre parecchi vantaggi sopra altri roditori nello studio di un certo numero di malattie umane. Ad esempio, l’istopatologia dell’ammina N-nitrosobis(2-oxopropyl) (BOP) indotto da adenocarcinomi duttali in criceto è simile a tumori pancreatici umani, mentre BOP trattamento induce principalmente tumori della tiroide nei ratti e del polmone e tumori del fegato in topi1. Perché i criceti sono il solo piccolo roditore trovato per supportare la replica di adenovirus, sono anche il modello di scelta per i test basati su adenovirus oncolitici vettori e farmaci anti-adenovirus2,3,4. Un altro esempio in cui il modello di criceto offre un vantaggio su topi e ratti è nello studio di iperlipidemia. Gli esseri umani e criceti esibiscono molte somiglianze nelle vie metaboliche del lipido ed entrambe le specie portano il gene che codifica la proteina di trasferimento dell’estere del colesterile (CETP), che svolge un ruolo centrale nel lipido metabolismi, mentre CETP è assente in topi e ratti5. Inoltre, criceti sviluppano malattia emorragica più rappresentativa della manifestazione umana dopo esposizione a Ebola virus6. I criceti sono anche i modelli di scelta per lo studio di aterosclerosi7, carcinoma orale8e myopathies infiammatori9. Recentemente, è stato dimostrato anche che i criceti sono altamente suscettibili all’infezione del virus di Ande e sviluppano hantavirus polmonare sindrome-come la malattia, fornendo il modello solo roditore di Andes virus infezione10.
Per affrontare il bisogno insoddisfatto per romanzo genetiche modelli animali studiare le malattie umane, dove nessun modello di roditore piccolo affidabile è disponibile, siamo recentemente riusciti nell’applicare il sistema CRISPR/Cas9 per il criceto e hanno prodotto geneticamente diverse linee di criceti derivati dal11. Zigoti criceto sono altamente sensibili ad ambienti ambientali tali che i protocolli di iniezione PN sviluppati in altre specie non sono adatti. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un protocollo di iniezione PN per il criceto che soddisfa i requisiti speciali per la movimentazione di criceto embrioni in vitro. Qui, descriviamo la procedura dettagliata di iniezione PN utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e accompagnamento di Spagna, dalla preparazione della singola guida di RNA (sgRNA) per il trasferimento di embrioni iniettati nelle femmine destinatario.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per sfruttare meglio il potenziale di criceti dorati siriani come modelli della malattia umana, abbiamo sviluppato un protocollo di iniezione PN per la consegna di un CRISPR/Cas9 complesso per impostare come destinazione il genoma di criceto. Il protocollo di iniezione PN ottimizza diverse variabili chiave, tra cui il terreno di coltura dell’embrione, la temperatura e lunghezze d’onda della luce13. Ci sono anche parecchie procedure di gestione animale criceto-specifica che è necessario seguire pe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal istituti nazionali di Allergy and Infectious Diseases (NIAID) dei National Institutes of Health, sotto il 1R41OD021979 numero premio (a ZW) e di un assegno di ricerca dal 21 BioGreen Next-Generation Programma, Repubblica di Corea, concedere no. PJ01107704 (a ZW) e concedere no. PJ01107703 (per IK). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health o BioGreen 21. Ringraziamo il dottor Nikolas Robl per il manoscritto di editing.
Materials
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 ug/ul (~6.1 uM) |
| GeneArtTM Precision Synthesis Kit | Invitrogen | A29377 | For sgRNA synthesis |
| Albumin from human serum | Sigma | A1653 | For cultivation medium |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | For embryo transfer |
| Incubator | New Brunswick | Galaxy 14S | For embryo cultivation |
| Microforge | Narishige | PB-7 | For making injection needles |
| Microscope | Nikon | ECLIPSE Ti-S | For microinjection |
| Microscope | invitrogen | SMZ745T | For embryo transfer |
| Mineral oil | Sigma | M1840 | Keep in dark |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | For superovulation |
Referências
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