Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול

Published: January 28, 2018 doi: 10.3791/56528
Automatic Translation
1, 1, 1
1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

Summary

שיטה זו מאפשרת מכתים סלקטיבית, כימות של ה-DNA של ג'לים למסמס את הג'ל ירוקה SYBR אני / ניטרו Tetrazolium כחול פתרון וחשיפת אז זה אור שמש או מקור אור כחול. זה מייצר את התמיסה גלוי ודורשת כמעט ללא ציוד, שהופך אותו אידיאלי לשימוש שדה.

Abstract

שיטות מכתימים DNA חשובים מאוד למחקר ביורפואי. תיכננו שיטה פשוטה המאפשרת ויזואליזציה DNA בעין בלתי מזוינת על ידי היווצרות התמיסה צבעוניים. זה עובד על ידי השריה של אקרילאמיד או agarose DNA ג'ל בריכוז של 1 x (שקול ל- 2.0 מיקרומטר) SYBR Green אני (SG אני), מ מ 0.20 ניטרו כחול tetrazolium שמייצר סגול לזרז של formazan כאשר הם נחשפים לאור השמש או אור כחול במיוחד. בנוסף, בדיקות דנ א השחזור בוצעו באמצעות פלסמיד עמיד אמפיצילין ב ג'ל agarose צבעונית עם השיטה שלנו. מספר גדול יותר של המושבות הושג בשיטה שלנו מאשר עם מסורתיים מכתים באמצעות ג. אני עם תאורה אולטרה סגולה. השיטה המתוארת הוא מהיר ספציפיים, שאינם רעילים עבור זיהוי ה-DNA, המאפשר ויזואליזציה של מולקולות "בעין בלתי מזוינת" בלי transilluminator, והוא מתאים לשימוש שדה וזולה. מסיבות אלו, יש DNA החדש שלנו מכתים שיטה היתרונות הפוטנציאליים לפעילות המחקר והתעשייה.

Introduction

עם ההתקדמות לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית, מחקרים שכללו דנ א דרושים טכניקות טובות יותר כדי לנתח את הדנ א. השיטה הראשונה עבור ה-DNA מכתים היה כסף מכתים, הרגישה מאוד אבל חסר סלקטיביות, אינו מאפשר שחזור הדגימה. מאוחר יותר, ההתפתחות של צביעת DNA פלורסנט מותר כימות סלקטיבי של ה-DNA עם האפשרות של שחזור הדגימה. אחד צבעי פלורסנט הראשון משמש DNA כימות היה אתידיום ברומיד1, אשר הוא מוטגניות2. עם זאת, כעת ישנם צבעי פלורסנט משופרת, כי הם יותר רגישים, כגון GelRed ו- SYBR Green ובטוחה אני (SG אני)3; אבל כל אלה צבעי פלורסנט מחייבות השימוש של אולטרה סגול (UV) transilluminator או fluorimeter.

ישנן טכניקות אחרות עבור בעליל מכתים ה-DNA, כגון מתילן כחול4 וקריסטל ויולט5,6,7,8,9, אך כל אלה סובלים רגישות מופחתת, סלקטיביות. המלחים tetrazolium הן תרכובות אורגניות רגישים צמצום, כאשר זה קורה הם יוצרים לא מסיס, formazan צבעוניים לזרז10,11. לאחרונה, כמה מלחים tetrazolium טרינארית הוכחו לאגד DNA עקב שלהם טבעות חיובי tetrazolium12.

האחרונות הפרסום13, הוצע טכניקה גלויה חדשה כדי להכתים ולכמת DNA ב לזיהוי ג'לים, באמצעות הפחתת מלח tetrazolium טרינארית בשם ניטרו כחול tetrazolium (NBT) ו צבעי פלורסנט כמו אתידיום ברומיד, GelRed, SYBR ירוק אני וזהב SYBR. התגובה הזו עבד בנוכחות אור כחול או אור שמש ואיפשר שחזור הדגימה עם איכות משופרת בהשוואה לשימוש של ס ג אני transilluminator UV. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט לשיטת ההגדלה באמצעות tetrazolium מלחי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ויפעילו את הג'ל

  1. הכינו את הלא-denaturing 12% ג'ל לזיהוי ג'לים בעזרת המתכון נתרן Dodecyl סולפט-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) נמצא Sambrook וראסל14 אך באמצעות מים במקום מרחביות.
    1. כדי להכין 5 מ ל ג'ל לפתרון, השתמש 1.7 מ ל מים מזוקקים, 2 מ של אקרילאמיד/bis אקרילאמיד (30/0.8% w/v), מ 1.3 ל 1.5 M טריס pH 8.8, מ 0.05 ל 10% קירור ו 0.002 מ"ל של TEMED.
    2. להכין 2 מ ל ג'ל הערימה להשתמש 1.5 מ ל מים, 0.33 מ של אקרילאמיד/bis אקרילאמיד (30/0.8% w/v), 0.25 mL של 1 מ' טריס pH 6.8, מ 0.02 נקודות ל 10% קירור ו 0.002 מ"ל של TEMED. הממדים של הג'ל הם 7.3 ס מ x 8.2 ס מ x 0.075 ס"מ (l x ע w x).
      הערה: משתמש במסרק טוב 15 של 0.75 מ מ עובי על הרגישות הכי טוב.
  2. הוסף את כמויות מתאימות של 6 x טעינת מאגר ודגימת דנ א כדי צינור microcentrifuge 1.5 mL (למשל שימוש 1 µL x 6 טעינת מאגר כדי µL 5 של דנ א).
  3. מקם את הג'ל בבית הבליעה אלקטרופורזה אנכי.
    1. למלא את החדר עם 750 מ ל 1 מאגר x TAE לבדוק 2 משטחים. להכנת 1 ליטר של 50 x TAE, השתמש g 442 בבסיס טריס, 57.1 מ ל חומצה אצטית קרחונית, 100 מ של 0.5 M EDTA pH 8. להוסיף מים מזוקקים נפח סופי של 1 ל'
    2. לטעון את הדגימות הג'ל. הפעל את הג'ל ב- 100 וולט כבר שעתיים.
  4. לחלופין, להכין 1 x TAE agarose ג'ל באמצעות מתכון שנמצאו Sambrook14.
    1. להוסיף 300 מ של 1 x TAE אל התא אלקטרופורזה אופקית. הפעל את ג'ל למשך 45 דקות ב- 100 וולט.

2. NBT-SG אני מכתימה (איור 1).

  1. ג'ל אקרילאמיד מכתים.
    1. להכין את הפתרונות: 0.1% w/v NBT ו- 1.2 x ג אני.
      הערה: ניתן להשתמש אתידיום ברומיד, GelRed וזהב SYBR במקום ס ג אבל ג היה לי את הביצועים הטובים ביותר.
    2. יוצקים 16.75 מיליליטר 1.2 x SYBR ירוק אני הפתרון לתוך מיכל בגודל המתאים.
      הערה: . היינו המכסה של תיבה עצה פיפטה כגורם מכיל, אמצעי אחסון אלה מחושבים כדי לכסות את הג'ל משתמשים במיכל הזה; המימדים הם 11.6 ס מ x 7.6 ס"מ x 2.6 ס"מ (l x ע w x).
    3. מקם את הג'ל הפתרון. להוסיף 3.25 מ של 0.1% w/v NBT פתרון לתת 0.2 מ מ NBT ו- x 1 (שקול ל- 2.0 מיקרומטר) ס ג אני ריכוזים הסופי.
    4. לאטום את המיכל עם הסרט פלסטיק, לחלוטין לעטוף את המכולה ברדיד אלומיניום, כדי לחסום את כל אור מקיף.
      הערה: הסרט פלסטיק משמש למניעת ניתזים וכדי למנוע תגובה של רדיד האלומיניום עם הפתרון מוכתמים.
    5. לנער 25 דקות על תפקודי לב / נשימה-60 סל ד.
    6. הסר אלומיניום מכסה פלסטיק. לחשוף אור מקסימלית 90 דקות. בדוק כל 5 דקות עד להופעת הלהקה עניין.
    7. כדי להשתמש אור כחול, להכין את protoboard עם 3 דיודות פולטות אור (LED) ומניחים על הנוריות כ- 5 מ"מ מהמשטח ג'ל (בדוק ההכתמה באופן רציף, משך הזמן הדרוש יהיה תלוי האינטנסיביות של מקור האור LED).
  2. ג'ל Agarose מכתים.
    1. לאחר הכנת והפעלה של agarose 1% ג'ל כמתואר בסעיפים 1.4 (הממדים הם 1 ס מ x 6.2 ס מ x 7 ס מ; l x w x d), בצע את הצעדים אותם כמו 2.1 עם שינויים אלה:
    2. יוצקים 41.9 מיליליטר 1.2 x ג אני פתרון למכסה של תיבה עצה פיפטה; המימדים הם 11.6 ס מ x 7.6 ס"מ x 2.6 ס"מ (l x ע w x). הוסף 8.1 מ של 0.1% NBT פתרון.
    3. לאטום את המיכל עם הסרט פלסטיק ולאחר מכן לחלוטין לעטוף את המכולה ברדיד אלומיניום, כדי לחסום את כל תאורת.
    4. לנער h 1 ב תפקודי לב / נשימה-60 סל ד.

3. נתונים ניתוח.

  1. NBT-SG אני עקומות כיול.
    1. לקבל תמונות ג'ל על-ידי סריקה ברזולוציה של 1200 dpi.
    2. תוכנה פתוחה עבור ניתוח תמונות. יישר את התמונות באמצעות עורך תמונות. הפעל את densitometry של התמונה.
    3. לחשב את השטח מתחת לעקומה. הכינו את גרף של האות/אותמקס לעומת ריכוז ה-DNA.

4. DNA השחזור.

  1. הכנת ג'ל agarose 1% 1 x TAE בעזרת המתכון שנמצאו Sambrook14.
  2. להוסיף 300 מ של 1 x TAE אל התא אלקטרופורזה אופקית. לטעון µL 4 של 100 ng/µL pDJ10015 פלסמיד, סולם הדנ א בעקבות ערכת נתון באיור2. הפעל את הג'ל מאובטח ב- 100 וולט.
  3. מארק, שוקל שני צינורות microcentrifuge 2 מ"ל.
  4. חותכים את הג'ל למטה באמצע כדי שיהיה זהה לשני חצאים. כל אחד צריך להכיל את הסולם, על פלסמיד מדגם להשוות את טכניקות צביעת שונים. ייצוג סכמטי הוא באיור2.
  5. כתם אחד חצי עם NBT-SG. אני כמו שלב 2.
    1. לגזור את הלהקה פלסמיד באמצעות אזמל נקי. להציל את החתיכה ג'ל בצינור אחד ומשקלו.
  6. כתם החלק השני של הג'ל עם ס ג אני עם 50 מ של 1 x ג אני הפתרון וללחוץ לאט (60 סל ד) את הג'ל על 1 h בחשכה.
    1. להניח את הג'ל על transilluminator ולחשוף עבור 2 דק לחתוך את הלהקה פלסמיד באמצעות אזמל נקי.
    2. לשמור את החתיכה ג'ל בצינור השני, שוקל.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה תוך שמירה על הצינורות ב-20 ° C.
  7. לבצע את החילוץ פלסמיד באמצעות ערכת חילוץ ג'ל מסחרי.

5. פלסמיד נורמליזציה.

  1. צינור microcentrifuge 1.5 mL, להוסיף 10 µL של פלסמיד שחולצו µL 60 סוג אני מים. מיקס להעביר cuvette קוורץ 60 µL או להשתמש 2 µL ישירות Nanodrop.
  2. למדוד את ספקטרום בליעה בין 230 ל 320 ננומטר. חישוב פלסמיד הריכוז של המדגם באמצעות הנוסחה הבאה:
    Equation 1
    איפה D הוא הגורם לדילול חלה (במקרה הזה זה 70/10), Ax הוא קליטה ב- x nm ו- 50 הוא פקטור המרה µg/mL עבור dsDNA.
  3. לדלל דגימות 9.1 ng/µL.
  4. שינוי צורה Escherichia coli (e. coli) המוסמכת תאים (למשל XL10 זהב) בעקבות ה ינו טרנספורמציה הליך-16 באמצעות µL 5 שתדללו מדגם.
  5. לספור את מספר מושבות על בצלחות פטרי ושים לב הדילול. לחשב את המושבה יוצרי יחידות (CFU) עם הבאים נוסחה17:
    Equation 2
    איפה D היא הגורם דילול מאובייקט התרבות הראשונית.
  6. לבצע מבחן-t אינטראקצית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התמיסה formazan סגול מופיע היכן ממוקם ה-DNA (נבדק על ידי ספקטרומטר מסה13). בניסוי, סולם הדנ א נטען לבצע עקומת כיול (איור 3). הפרוטוקול פועל עבור ג'לים אקרילאמיד והן agarose, אך יש עוצמה נמוכה יותר והוא לוקח זמן רב יותר agarose. עם זאת, השימוש agarose ג'ל מאפשר ההתאוששות של המדגם באמצעות ערכת זמינים מסחרית, זה לא מפריע החילוץ. הדגימות התאושש באמצעות שיטה זו עם נוריות כחולות יש איכות טובה יותר בהשוואה לס ג אני משתמש של transilluminator (איור 4).

Figure 1
איור 1. מכתים סכמטי של NBT-ס ג I DNA וניתוח כמת. השלבים הם: הוספת א ס ג ו- NBT פתרונות לג'ל. B. חושפת את הג'ל אור השמש או אור כחול. ג סורק את הג'ל ברזולוציה של 1200 dpi. ד ניתוח התמונה ג'ל על-ידי תמונה עיבוד תוכנה כדי לקבל עוצמת הלהקה. אי התוויית הנתונים בעוצמה לעומת ריכוז עלילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . סכמטי של DNA שחזור ותקינות השוואה assay. א דנ אלקטרופורזה. B. חיתוך ג'ל לתוך שתי חתיכות. ג מכתים עם שתי השיטות מכתימים שונים (SG אני ו- NBT-SG אני). ד חיתוך פלסמיד DNA הלהקה. ה DNA ג'ל הליך חילוץ באמצעות ערכת חילוץ. פ דנ כמת על ידי מדידה ספקטרופוטומטר. ג'י הדי נורמליזציה ריכוז כדי להשוות בין שתי השיטות. ה טרנספורמציה חיידקי עם הדגימות לאחר נורמליזציה סומך אני מושבת וניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . עקומת כיול של ה-DNA ב bp 1500 באמצעות i: NBT-SG 12.5% לזיהוי ג'לים עמוסות ריכוזים שונים של סולם הדנ א. ג'לים נוהלו ב- 100 וולט עבור 2 h 1 x TAE. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . השוואה של יעילות טרנספורמציה בין DNA דמיינו ס ג אני ו transilluminator i: NBT-SG פלסמיד pDJ100 היה טעון ב 1% agarose ג'ל ולרוץ 100 וולט לשעה 1 x TAE. ואז הג'ל נחתך לשני חצאים. חצי הוכתם ס ג אני ואת החצי השני של הג'ל עם NBT-SG אני. הלהקה פלסמיד ואז היה שחולצו מן הג'ל באמצעות ערכת חילוץ ג'ל. לבסוף פלסמיד שחולץ היה מנורמל, המשמש לשינוי תאים המוסמכת e. coli . השינויים בוצעו n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הרומן ורגיש DNA מכתים שיטה מבוסס על הפחתת NBT השימוש של ס ג. הוצגתי במאמר זה. השלב הקריטי של פרוטוקול זה הוא זמן הדגירה של הג'ל ב NBT-ס ג אני פתרון וריכוז NBT. הזמן מוכתמים agarose ג'ל הוא ארוך יותר עבור אקרילאמיד ג'לים בשל עובי גדול יותר agarose ג'ל. שיטה זו אינה פועלת היטב בנוכחות מרחביות כפי NBT ארגונייט שוקע במגע עם זה. אם הג'ל משיג רקע סגול, אנו ממליצים על כך עוד ג'ל להיות מוכן כדי לצמצם את זמן חשיפה קלה. אם ג'ל agarose היא מוכתמת, ואין רגישות מספיק, מומלץ להגדיל את הזמן לאור החשיפה. אם יש חוסר הרגישות התמיסה שאדרה קיים הג'ל, זה יכול להיות התוצאה של זיהום מרחביות. במקרה הזה, הכנת ג'ל חדש ולשטוף אותו לפני הוספת ריאגנטים מכתימים.

המשקעים מתרחשת על ידי תאורה אור כחול, אם מסופק על ידי אור LED כחול או בהווה אור כחול באופן טבעי באור השמש. בגלל זה, מגבלה של הטכניקה היא מקור האור. אם אין מקור האור, מקור אור כחול דרוש, ואם מקור האור אינה הומוגנית, זה בלתי אפשרי לעשות השוואה, מאותה סיבה, זה לא אפשרי לעשות כמת. עם זאת, התוצאות המתקבלות תהיה תלויה במידת מה מקור האור בשימוש. אם מקור האור אינה עקבית או מדים (למשל עקב שינויים בעוצמת אור השמש במהלך היום או אי-הומוגניות מקור אור כחול), זה יהיה קשה יותר לביים השוואות או כימות של מדגמים שונים ברמות שונות פעמים.

בשיטה זו אין צורך במכשור מיוחד כדי להמחיש את הדנ א, שהופך אותו אידיאלי לשימוש שדה. לקבלת תוצאות כמותיות, אחד באפשרותך להשתמש במצלמה ברזולוציה גבוהה או סורק office כמוצג בעבודה זו.

אנו מקווים להרחיב את הטכניקה הזו בעתיד על ידי ואולי שילוב עם צביעה של מולקולות אחרות באמצעות שתי טכניקות צביעת שונים (למשל NBT-SG. אני עם Coomassie) באותו הג'ל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי Fondo נאסיונאל דה Desarrollo y אזור Tecnológico (Fondecyt), צ'ילה, פרויקט 11130263 (ל CW), פרויקט CONICYT + NERC + פרוגרמה דה Colaboración אינטרנסיונל PCI-PII20150073 (ל CW) ו- U-inicia מדה Vicerrectoría Investigación אוניברסידאד דה צ'ילה (ל CW).

תודה על טטיאנה נאראנחו-פלמה על העזרה בשלב הראשוני של הפרויקט, ד ר חורחה Babul, דייגו קירוגה-רוג'ר לדיון מועיל, רוברט Lesch עבור תיקון של כתב היד, Dirección דה extensión דה לה Facultad דה y Químicas עצמה Farmacéuticas מ אוניברסידאד דה צ'ילה. תודות גם מרסלו Pérez עבור עריכת הוידאו וסטיבנס ניל שתיקנת את הטקסט ואת ארול ווטסון למתן הקריינות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nitro blue tetrazolium Gold Biotechnology 298-83-9 reagent used in the staining
SYBR Green I 10000X Thermo-Fisher S7563 reagent used in the staining
Gel extraction kit QIAGEN 28704 used to extract plasmid from the gel in integrity assay
DNA ladder Thermo-Fisher SM 1331 used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay
Agar Agar Merck used to make LB-ampicillin culture plates 
sodium chloride Merck 1064045000 used to make LB-ampicillin culture plates 
yeast extract Becton, Dickinson and Company 212750 used to make LB-ampicillin culture plates 
peptone Merck 72161000 used to make LB-ampicillin culture plates 
TEMED AMRESCO 761 used to make polyacrylamide gels
ammonium persulfate Calbiochem 2310 used to make polyacrylamide gels
acrylamide invitrogen 15512-023 used to make polyacrylamide gels
bisacrylamide SIGMA 146072 used to make polyacrylamide gels
Tris-base Merck 1083821000 used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
EDTA J.T. Baker 8993-01 used to make TAE buffer
Acetic acid Merck 1,000,632,500 used to make TAE buffer
agarose Merck 16802 used to make TAE buffer
spectrophotometer Tecan infinite 200 pro used to quantify DNA plasmid
water purificatiom unit Merck Elix 100 use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\
distilled water - used in gels, culture medium, stainings and general solutions
HCl J.T. Baker 9535-03 used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer
6X DNA loading dye Thermo-Fisher R0610
5 mm Blue LED Jinyuan electronics SP-021 light source used in integrity assay
protoboard KANDH KH102 light source support and circuit 
9 V battery Duracell - used to power the LED's
horizontal electrophoresis chamber Biorad 1704486EDU used to make and run agarose gel in integrity assay
vertical electrophoresis kit Biorad 1658002EDU used to run polyacrylamide gels in calibration curves
power supply Biorad 1645050  used to power the electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
  2. Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
  3. Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
  4. Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
  5. Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
  6. Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
  7. Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
  8. Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
  9. Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
  10. Altman, F. P. Tetrazolium salts and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 9 (3), 1-56 (1976).
  11. Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
  12. Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
  13. Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
  14. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  15. Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
  16. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  17. Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).

Tags

ביוכימיה גיליון 131 DNA מכתים שלמות הדנ א ה-DNA כמת SYBR ירוק Formazan Tetrazolium כחול ניטרו אור כחול
DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Paredes, A. J.,… More

Paredes, A. J., Alfaro-Valdés, H. M., Wilson, C. A. M. DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure. J. Vis. Exp. (131), e56528, doi:10.3791/56528 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter