Summary
Denna metod tillåter Selektiv färgning och kvantifiering av DNA i geler genom blötläggning gelen i en SYBR Green jag / Nitro Blue Tetrazolium lösning och sedan utsätta den för solljus eller en blå ljuskälla. Detta producerar en synlig fällning och kräver nästan ingen utrustning, vilket gör den idealisk för användning i fält.
Abstract
DNA färgning metoder är mycket viktiga för biomedicinsk forskning. Vi har utformat en enkel metod som gör DNA visualisering för blotta ögat vid bildandet av en färgad fällning. Det fungerar genom att blötlägga akrylamid eller agaros DNA gel i en lösning av 1 x (motsvarar 2,0 µM) SYBR Green jag (SG jag) och 0,20 mM nitro blue tetrazolium som producerar en lila fällningen av formazan när de utsätts för solljus eller speciellt blått ljus. Även utfördes DNA återhämtning tester med en ampicillin resistenta plasmid i en agarosgel färgas med vår metod. Ett större antal kolonier erhölls med vår metod än med traditionella färgning med SG jag med ultraviolett belysning. Den beskrivna metoden är snabb, specifika och icke-giftiga för DNA detektering, möjliggör visualisering av biomolekyler ”blotta ögat” utan en transilluminator, och är billig och är lämpliga för användning i fält. Av dessa skäl har vår nya DNA färgning metod potentiella fördelar för både forskning och industri.
Introduction
Med framsteg inom biokemi och molekylär biologi, har i studier på DNA krävs bättre tekniker för att analysera DNA. Den första metoden för DNA färgning var silver färgning, som är mycket känslig men saknar selektivitet och tillåter inte provet återhämtning. Senare, tillåtet utvecklingen av fluorescerande DNA färgning selektiv kvantifiering av DNA med möjligheten till provet återhämtning. En av de första fluorescerande färgämnen används för DNA kvantifiering var etidiumbromid bromid1, som är mutagena2. Men nu finns det förbättrade fluorescerande färgämnen som är säkrare och mer känsliga, såsom GelRed och SYBR Green jag (SG jag)3. men alla dessa fluorescerande färgämnen kräver användning av en ultraviolett (UV) transilluminator eller fluorimeter.
Det finns andra tekniker för synbart färgning DNA, såsom metylenblått4 och kristallviolett5,6,7,8,9, men alla dessa lider av minskad känslighet och selektivitet. Tetrazolium salter är organiska föreningar som är mottagliga för minskning, och när detta händer de bilda en olöslig och färgade formazan fällningen10,11. Vissa bivalent tetrazolium salter har nyligen visat att binda till DNA på grund av sin positiva tetrazolium ringar12.
I en senaste publikation13föreslogs en ny synlig teknik att fläcken och kvantifiera DNA i polyakrylamidgeler, med hjälp av minskning av ett bivalent tetrazolium salt kallas nitro blue tetrazolium (NBT) och fluorescerande färgämnen som etidiumbromid, GelRed, SYBR Green I och SYBR guld. Denna reaktion arbetade i närvaro av blått ljus eller solljus och tillåtet prov återhämtning med förbättrad kvalitet i förhållande till användningen av SG I med en UV-transilluminator. Syftet med denna uppsats är att tillhandahålla ett detaljerat protokoll av färgning tekniken använder tetrazolium salter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda och kör gelen
- Förbereda de icke-denaturering 12% Polyakrylamidgelen geler med Sodium Dodecyl Sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) receptet finns i Sambrook och Russell14 men med vatten istället för SDS.
- För att förbereda 5 mL lösa gel, Använd 1,7 mL destillerat vatten, 2 mL av akrylamid/bis akrylamid (30/0,8% w/v), 1,3 mL 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL 10% ammonium persulfatoxidation och 0,002 mL TEMED.
- För att förbereda Använd 2 mL stapling gel 1,5 mL vatten, 0.33 mL av akrylamid/bis akrylamid (30/0,8% w/v), 0,25 mL 1 M Tris pH 6,8, 0,02 mL 10% ammonium persulfatoxidation och 0,002 mL TEMED. Måtten på gelen är 7,3 x 8,2 cm x 0,075 cm (l x b x d).
Obs: Använd en 15 väl kam 0,75 mm tjocklek för bästa känslighet.
- Lägga till lämpligt belopp av 6 x laddar buffert och DNA-prov till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör (t.ex. Använd 1 µL 6 x lastning buffert till 5 µL av DNA-prov).
- Placera gelen i vertikal elektrofores kammaren.
- Fyll kammaren med 750 mL 1 x TAE buffert att köra 2 geler. Att förbereda 1 L 50 x TAE, använda 442 g för Tris base, 57,1 mL isättika och 100 mL 0,5 M EDTA pH 8. Tillsätt destillerat vatten till en slutlig volym av 1 L.
- Läsa in proverna i gelen. Kör gelen vid 100 V för 2 h.
- Du laga en 1 x TAE agarosgel med receptet hittade i Sambrook14.
- Tillsätt 300 mL 1 x TAE till horisontell elektrofores kammaren. Kör gelen för 45 min vid 100 V.
2. NBT-SG jag färgning (figur 1).
-
Akrylamid Gel färgning.
- Förbereda lösningarna: 0,1% w/v NBT och 1.2 x SG jag.
Obs: Det är möjligt att använda etidiumbromid, GelRed och SYBR guld istället för SG jag, men SG jag hade bästa prestanda. - Häll 16.75 mL 1.2 x SYBR grön jag lösning i en behållare av lämplig storlek.
Obs: Vi använde locket på en pipett tip låda som en behållare, och dessa volymer beräknas täcka gelen använda denna behållare; dess dimensioner är 11,6 x 7,6 cm x 2,6 cm (l x b x d). - Placera gelen i lösningen. Lägg till 3,25 mL 0,1% w/v NBT lösning att ge 0,2 mM NBT och 1 x (motsvarar 2,0 µM) SG jag slutliga koncentrationer.
- Tillslut kärlet med plastfilm, och helt Linda behållaren med aluminiumfolie att blockera ljus från omgivningen.
Obs: Plastfilmen används för att förhindra stänk och undvika reaktion av aluminiumfolie med färglösningen. - Skaka i 25 minuter i orbitalskak vid 60 rpm.
- Ta bort aluminium och plastskyddet. Utsätta för solljus för 90 min maximala. Kontrollera varje 5 min tills bandet av intresse visas.
- För att använda blått ljus, förbereda en prototypkort med 3 lysdioder (LED) och placera lampor ca 5 mm från gel ytan (kontrollera färgningen kontinuerligt, som tiden behövs beror på intensiteten av den LED-ljuskällan).
- Förbereda lösningarna: 0,1% w/v NBT och 1.2 x SG jag.
-
Agarosgel färgning.
- Efter förberedelser och kör en 1% agaros gel som beskrivs i avsnitt 1.4 (måtten är 1 x 6,2 cm x 7 cm; l x w x d), följ samma steg som i 2.1 med dessa ändringar:
- Häll 41,9 mL 1,2 x SG jag lösning i locket för en pipett tip box; dess dimensioner är 11,6 x 7,6 cm x 2,6 cm (l x b x d). Lägg till 8,1 mL 0,1% NBT lösning.
- Försegla containern med plastfilm, och sedan helt Linda behållaren med aluminiumfolie att blockera ljus från omgivningen.
- Skaka för 1 h i orbitalskak vid 60 rpm.
3. dataanalys.
-
NBT-SG jag kalibreringskurvor.
- Få gel-bilder genom att skanna på 1200 dpi.
- Öppen programvara för bildanalys. Räta ut bilderna med en bildredigerare. Kör en bild densitometry.
- Beräkna arean under kurvan. Förbereda en graf av Signal/SignalMax kontra DNA-koncentration.
4. DNA återhämtning.
- Förbereda en 1% agarosgel i 1 x TAE använda receptet hittade i Sambrook14.
- Tillsätt 300 mL 1 x TAE till horisontell elektrofores kammaren. Ladda 4 µL av 100 ng/µL pDJ10015 plasmid och DNA stege efter det system som anges i figur 2. Kör gelen för 1 h vid 100 V.
- Markera och väger två 2 mL mikrocentrifugrör.
- Klipp gelen i mitten för att få två identiska halvor. Var och en bör innehålla stegen och prov plasmiden att jämföra de olika färgning teknikerna. En schematisk representation är i figur 2.
- Färga en halv med NBT-SG jag som i steg 2.
- Klipp ut plasmid bandet med en ren skalpell. Spara den gel bit i en tub och väger.
- Färga den andra delen av gelen med SG jag med 50 mL 1 x SG jag lösning och långsamt skaka (60 rpm) gelen för 1 h i mörker.
- Placera gelen på ett transilluminator och utsätta för 2 min. skär ut plasmid bandet med en ren skalpell.
- Spara den gel bit i andra röret och väger.
Obs: Protokollet kan pausas här samtidigt hålla rören vid-20 ° C.
- Genomföra plasmid extraktion med en kommersiell gel utvinning kit.
5. plasmid normalisering.
- Lägg till 10 µL av extraherade plasmid och 60 µL av typen jag vatten i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Mix och överföra till en 60 µL kvarts kyvetten eller Använd 2 µL direkt i en Nanodrop.
- Mäta Absorptionsspektra mellan 230 till 320 nm. Beräkna provets plasmid koncentration med hjälp av följande formel:
där D är utspädningsfaktorn tillämpas (i detta fall är det 70/10), Ax är absorption vid x nm och 50 är konverteringsfaktorn till µg/mL för dsDNA. - Späd prover till 9,1 ng/µL.
- Omvandla Escherichia coli (E. coli) behöriga celler (t.ex. XL10 guld) efter Inoue omvandling förfarande16 använder 5 µL utspädda provet.
- Räkna antalet kolonier på Petriskålarna och observera utspädning. Beräkna den Colony Forming enheter (CFU) med följande formel17:
där D är utspädningsfaktorn tillämpas från den ursprungliga kulturen. - Utför ett oparat t-test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En lila formazan fällning visas där DNA ligger (verifierad av masspektrometri13). I experimentet lästes en DNA-stege för att göra en kalibreringskurva (figur 3). Protokollet fungerar för både akrylamid och agaros gel, men den har en lägre intensitet och tar längre tid i agaros. Men användningen av agaros gel tillåter återvinning av provet med en kommersiellt tillgänglig kit, och det stör inte utvinning. De prover som återhämtat sig med den här metoden med blå lysdioder har en bättre kvalitet jämfört med SG jag använder en transilluminator (figur 4).
Figur 1. Schematisk av NBT-SG I DNA analys för färgning och kvantifiering. Stegen är: A. lägga till SG jag och NBT lösningar till gelen. B. utsätta gelen för solljus eller blått ljus. C. skanning gelen på 1200 dpi. D. analysera gel bilden av ett bildbehandlingsprogram för att få bandet intensitet. E. Rita data i ett intensitet kontra koncentration tomt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Schematisk av DNA återhämtning och integritet jämförelse assay. A. DNA elektrofores. B. skärande gel i två bitar. C. färgning med de två olika färgning metoderna (SG jag och NBT-SG jag). D. skära ut plasmid DNA band. E. DNA gel extraktionsmetod med utvinning kit. F. DNA kvantifiering genom spektrofotometri mätning. G. DNA koncentrationen normalisering att jämföra de två metoderna. H. bakteriell omvandling med prover efter normalisering I. kolonin räknar och dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Kalibreringskurvan av DNA på 1500 bp använder NBT-SG I: 12,5% polyakrylamidgeler laddad med olika koncentrationer av DNA stege. Geler kördes på 100 V för 2 h i 1 x TAE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Jämförelse av förvandling effektivitet mellan DNA visualiseras med SG jag transilluminator och en NBT-SG I: pDJ100 plasmiden var laddad i en 1% agarosgel och kör på 100 V för 1 h i 1 x TAE. Sedan skars gelen i två halvor. Hälften var fläckade SG jag och andra hälften av gelen med NBT-SG jag. Plasmid bandet var sedan ur gelen med en gel utvinning kit. Slutligen var den extraherade plasmiden normaliserade och används för att transformera E. coli behöriga celler. Omformningarna genomfördes n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En känslig och roman DNA färgning metod baserad på minskning av NBT och användningen av SG jag presenterades i denna artikel. Det kritiska steget i detta protokoll är inkubationstiden av gelen i NBT-SG jag lösning och koncentrationen av NBT. Agaros gel färgning tid är längre än för akrylamid geler på grund av den större tjockleken av agaros gel. Denna metod fungerar inte väl i närvaro av SDS som NBT fällningar i kontakt med den. Om gelen erhåller en lila bakgrund, rekommenderar vi att en annan gel vara beredd och minska ljus exponeringstiden. Om en agarosgel är målat och det inte finns tillräckligt känslighet, det rekommenderas att öka tiden för ljusexponering. Om det finns en brist på känslighet och en opalskimrande fällningen är närvarande i gelen, kunde detta vara resultatet av SDS kontaminering. I så fall, förbereda en ny gel och skölj den innan du lägger till färgning reagenserna.
Fällning sker av blå ljus belysning, huruvida levereras av en blå LED eller blå ljus ljus presentera naturligt i solljus. På grund av detta är en begränsning av tekniken ljuskällan. Om det ingen ljuskälla, en blå ljuskälla behövs, och om ljuskällan inte är homogena, det är inte möjligt att göra en jämförelse, och av samma anledning, det är inte möjligt att göra kvantifiering. Resultaten kommer dock något beroende av den ljuskälla som används. Om ljuskällan inte är konsekvent eller uniform (t.ex. på grund av förändringar i intensitet av solljus under dagen eller icke-homogena blå ljuskälla), det blir svårare att direkta jämförelser eller kvantifiering av olika prover på olika gånger.
Denna metod behöver inte särskild instrumentation att visualisera DNA, vilket gör den idealisk för användning i fält. För kvantitativa resultat, kan man använda en högupplöst kamera eller en office-scanner som visades i detta arbete.
Vi hoppas att expandera denna teknik i framtiden genom att eventuellt kombinera det med färgningen av andra biomolekyler genom användning av två olika färgning tekniker (t.ex. NBT-SG jag med Coomassie) i samma gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt), Chile, projektet 11130263 (till CW), projektet CONICYT + NERC + Programa de Colaboración Internacional PCI-PII20150073 (till CW) och U-inicia från Vicerrectoría de Investigación Universidad de Chile (till CW).
Tack till Tatiana Naranjo-Palma för hjälpen i det inledande skedet av projektet, Dr Jorge Babul och Diego Quiroga-Roger för bra diskussion, Robert Lesch för att revidera de manuskript och Dirección de extensión de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas från Universidad de Chile. Tack också till Marcelo Pérez för redigering av video och Neil Stevens för att korrigera texten och Errol Watson för att tillhandahålla voice-over.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitro blue tetrazolium | Gold Biotechnology | 298-83-9 | reagent used in the staining |
| SYBR Green I 10000X | Thermo-Fisher | S7563 | reagent used in the staining |
| Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | used to extract plasmid from the gel in integrity assay |
| DNA ladder | Thermo-Fisher | SM 1331 | used to make calibration curves and as reference to cut band in integrity assay |
| Agar Agar | Merck | used to make LB-ampicillin culture plates | |
| sodium chloride | Merck | 1064045000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| yeast extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| peptone | Merck | 72161000 | used to make LB-ampicillin culture plates |
| TEMED | AMRESCO | 761 | used to make polyacrylamide gels |
| ammonium persulfate | Calbiochem | 2310 | used to make polyacrylamide gels |
| acrylamide | invitrogen | 15512-023 | used to make polyacrylamide gels |
| bisacrylamide | SIGMA | 146072 | used to make polyacrylamide gels |
| Tris-base | Merck | 1083821000 | used to make TAE buffer and non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | used to make TAE buffer |
| Acetic acid | Merck | 1,000,632,500 | used to make TAE buffer |
| agarose | Merck | 16802 | used to make TAE buffer |
| spectrophotometer | Tecan | infinite 200 pro | used to quantify DNA plasmid |
| water purificatiom unit | Merck | Elix 100 | use to make water type 1 (ASTM) used in spectrophotometry and DNA dilutions\ |
| distilled water | - | used in gels, culture medium, stainings and general solutions | |
| HCl | J.T. Baker | 9535-03 | used to make non-denaturing polyacrylamide gel tris-HCl buffer |
| 6X DNA loading dye | Thermo-Fisher | R0610 | |
| 5 mm Blue LED | Jinyuan electronics | SP-021 | light source used in integrity assay |
| protoboard | KANDH | KH102 | light source support and circuit |
| 9 V battery | Duracell | - | used to power the LED's |
| horizontal electrophoresis chamber | Biorad | 1704486EDU | used to make and run agarose gel in integrity assay |
| vertical electrophoresis kit | Biorad | 1658002EDU | used to run polyacrylamide gels in calibration curves |
| power supply | Biorad | 1645050 | used to power the electrophoresis |
References
- LePecq, J. B., Paoletti, C. A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization. J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).
- Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).
- Xin, X., Yue, S., Wells, K. S., Singer, V. L. SYBR Green-I: a new fluorescent dye optimized for detection picogram amounts of DNA in gels. Biophys. J. 66 (A150), (1994).
- Flores, N., Valle, F., Bolivar, F., Merino, E. Recovery of DNA from agarose gels stained with methylene blue. Biotechniques. 13 (2), 203-205 (1992).
- Yang, Y. I., Jung, D. W., Bai, D. G., Yoo, G. S., Choi, J. K. Counterion-dye staining method for DNA in agarose gels using crystal violet and methyl orange. Electrophoresis. 22 (5), 855-859 (2001).
- Yang, Y. I., et al. Detection of DNA using a visible dye, Nile blue, in electrophoresed gels. Anal. Biochem. 280 (2), 322-324 (2000).
- Santillán-Torres, J. L. A novel stain for DNA in agarose gels. Trends Genet. 9 (2), 40 (1993).
- Adkins, S., Burmeister, M. Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240 (1), 17-23 (1996).
- Cong, W. T., et al. A visible dye-based staining method for DNA in polyacrylamide gels by ethyl violet. Anal. Biochem. 402 (1), 99-101 (2010).
- Altman, F. P.
- Nineham, A. W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts. Chem. Rev. 55 (2), 355-483 (1955).
- Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).
- Paredes, A. J., et al. New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts. Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. , fourth, Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
- Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor. Cell. 45 (3), 397-406 (1986).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. Brock biology of microorganisms. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).
