إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من "التعديلات هستون" من Saccharomyces cerevisiae
Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن من هيستونيس المعدلة من مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae. إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي بعد ذلك تستخدم ل PCR الكمي لاستجواب بوفرة والتعريب من التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال في جميع أنحاء الجينوم.
Abstract
التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال (بتمس)، مثل أسيتيليشن ومثلايشن الفسفرة، بشكل حيوي ينظم سلسلة من الإنزيمات إضافة أو إزالة هذه العلامات في استجابة لإشارات تتلقاها الخلية. هذه بتمس مساهم رئيسي في تنظيم عمليات مثل التحكم في التعبير الجيني وإصلاح الحمض النووي. وقد إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) نهجاً مفيداً لتشريح وفرة وتوطين العديد من هيستون بتمس في جميع أنحاء الجينوم ردا على الاضطرابات المتنوعة للخلية. هنا، يتم وصف أسلوب متعدد الاستخدامات لأداء رقاقة هيستونيس بوستترانسلاتيونالي معدلة من مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae (س. سيريفيسيا) . يعتمد هذا الأسلوب على كروسلينكينج من البروتينات والحمض النووي باستخدام العلاج فورمالدهايد الخميرة الثقافات، جيل من الخميرة ليساتيس بحبه الضرب، solubilization الشظايا الكروماتين نوكلاس ميكروكوككال، وإيمونوبريسيبيتيشن من الحمض النووي هيستون المجمعات. هو تنقية الحمض النووي المرتبطة بعلامة هستون من الفائدة وإخضاعها لتحليل PCR الكمي لتقييم تخصيبها في مواقع متعددة في جميع أنحاء الجينوم. وتناقش تجارب تمثيلية السبر إضفاء الطابع المحلي على علامات هيستون H3K4me2 و H4K16ac في wildtype والخميرة متحولة لإثبات تحليل البيانات وتفسيرها. هذا الأسلوب هو مناسبة لمجموعة متنوعة من هيستون بتمس ويمكن أن يؤديها مع سلالات متحولة مختلفة أو حضور الضغوط البيئية المتنوعة، يجعلها أداة ممتازة للتحقيق في التغيرات في ديناميات الكروماتين تحت ظروف مختلفة.
Introduction
تعديل دينامية بوستترانسلاشونال (PTM) هيستونيس إليه تنظيمية رئيسية لكثير من العمليات موجودة في قالب الحمض النووي، بما في ذلك النسخ والنسخ المتماثل وإصلاح الحمض النووي1،2. القدرة على تحديد وفرة والترجمة الدقيقة لتعديل histones المتزامن مع هذه العمليات ذا أهمية حاسمة لفهم تنظيمها تحت ظروف مختلفة في الخلية. تطوير إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) كطريقة إلى حد كبير نابع من الدراسات البيوكيميائية لتفاعلات البروتينات مع الحمض النووي، ولا سيما في المختبر طرق استخدام كروسلينكيرس الكيميائية، إلى جانب الحاجة إلى تقييم الطبيعة الديناميكية للبروتين-الحمض النووي التفاعلات في الجسم الحي ، وفي مناطق محددة من الجينوم3،،من45. كما وسعت النهوض PCR الكمي (qPCR) وتقنيات التسلسل القدرة على القيام بتجارب رقاقة مع المقارنات الكمية وعبر جينومات كاملة، يجعلها أداة قوية لتشريح التفاعلات الحمض النووي من البروتين في مستويات متعددة.
حاليا، رقاقة أسلوب مطلوبة لأي فريق الأبحاث المهتمة في تنظيم الكروماتين بوساطة الجينوم كما توجد أية أساليب مماثلة لمباشرة استجواب الصلة المادية بين من هستون تعديل وموضع محدد المجينية في فيفو. على الرغم من الاختلافات في هذا الأسلوب باستخدام تسلسل الجيل القادم لخريطة التعديلات هيستون طوال ال6،الجينوم7 المتاحة، هذه النهج قد معالجة المسائل العلمية المختلفة والحجم، والتكلفة وقد حصر الموارد التقنية لبعض المجموعات البحثية. بالإضافة إلى ذلك، qPCR الشريحة المستهدفة اللازمة لتكملة هذه النهج بتوفير أساليب السواء تحسين البروتوكول رقاقة قبل التسلسل والتحقق من صحة النتائج من مجموعات البيانات ابيجينوميك. الكتلي على أساس نهج لتحديد المجموعة الكاملة من هستون علامات المرتبطة بمناطق الجينوم لها أيضا ظهر8،،من910،11، ولكن هذه وقد نهج بعض القيود التي يمكن سبر مناطق الجينوم وأنها تتطلب الخبرة التقنية والأجهزة التي لن تكون متاحة لجميع المجموعات البحثية. ولذلك، يظل رقاقة أسلوب تأسيسية لتحليل في وفرة وتوزيع تعديلات هيستون تحت ظروف متنوعة لجميع المجموعات البحثية المهتمة بالتخلق والكروماتين وتنظيم وظائف الجينوم.
هنا، نحن تصف طريقة لنموذج شريحة باستخدام الخميرة مهدها Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) للتحقيق في توزيع بتمس هستون في الكروماتين. ويعتمد هذا النهج على عدد من العناصر الأساسية للبروتوكولات رقاقة نمواً في الخميرة وتنطبق أيضا على نموذج مختلف نظم12،13. التفاعلات بين histones المعدلة والحمض النووي في الخلية هي الحفاظ crosslinking مع فورمالدهايد. بعد إعداد ليستي، هي solubilized الكروماتين الشظايا إلى شظايا الحجم موحد بالهضم مع نوكلاس ميكروكوككال. تتم إيمونوبريسيبيتيشن هيستونيس المعدلة مع الأجسام المضادة أما تجارية أو إنشاء مختبر وعزل أي الحمض النووي المرتبطة بها وتحليلها لتخصيب اليورانيوم في مناطق الجينوم معينة باستخدام قبكر (الشكل 1). لإدخال تعديلات كثيرة على هستون، الكمية من الحمض النووي التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول كافية لاختبار المكاني الجينوم مختلفة أكثر من 25 من قبكر.
يعد هذا الأسلوب رقاقة تنوعاً عاليا لمراقبة توزيع التعديل هيستون واحد عبر العديد من سلالات متحولة أو الظروف البيئية، أو لاختبار العديد من التعديلات هستون في الخلايا wildtype في عدد من مواضع الجينوم. وعلاوة على ذلك، العديد من مكونات بروتوكول قابلة للتعديل بسهولة لتحسين الكشف عن أما علامات عالية أو المتواضع-وفرة هيستون. وأخيراً، أداء رقاقة histones المعدلة في مهدها الخميرة يتيح الفرصة لاستخدام الضوابط الأساسية لخصوصية جسم متوفرة إلى حد كبير في النظم الأخرى. هما يمكن توليد سلالات الخميرة التي تحمل الطفرات في المخلفات هيستون المستهدفة للتعديل، وفي بعض الحالات، هناك فقط إنزيم واحد أن يحفز التعديل على بقايا هيستون خاصة (على سبيل المثال-يسين هيستون ميثيلترانسفيراسيس). لذلك، يمكن إجراء رقاقة في أما هيستون المسخ أو إنزيم الحذف السلالات الاعتداء مدى التي قد تحدث ملزمة غير محددة من الجسم وتوليد نتائج إيجابية كاذبة. عنصر التحكم هذا هو قيمة خاصة للأجسام المضادة التي وضعت حديثا، وحتى يمكن استخدامها للتحقق من صحة جسم خصوصية للتعديلات هيستون حفظت قبل استخدامها في أنظمة أخرى. ويكمل هذا النهج أساليب أخرى لاختبار الأجسام المضادة النوعية التي تميز بين الدول تعديل مختلفة (مثل مونو-دي-وثلاثي-مثلايشن)، بما في ذلك التدقيق صفائف الببتيدات المعدلة وأداء البقع الغربية من هيستونيس أو نوكليوسوميس مع تعديلات محددة. عموما، رقاقة في مهدها الخميرة طريقة قوية لتقييم ديناميات هيستون بتمس في جميع أنحاء الجينوم وتشريح الآليات التي تحكم تنظيمها.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح الإجراء الموضح هنا لاستعادة كفاءة من الحمض النووي المرتبطة بتعديل هيستونيس في خلايا الخميرة التي إيمونوبريسيبيتيشن. ويعقب هذا qPCR استخدام كبسولة تفجير وتضخيم المناطق ذات الاهتمام لتحديد تخصيب محلي أو نضوب تعديلات محددة هيستون. على الرغم من يجري تطويرها كأسلوب قبل 20 عاماً تقريبا، يظ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر أعضاء المختبر الخضراء لإجراء مناقشات مفيدة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا منح المعاهد الوطنية للصحة R03AG052018 و R01GM124342 إلى E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
Referências
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3′-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
