Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) של היסטון שינויים של האפייה
Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כרומטין immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מ שמרים ניצני האפייה. Immunoprecipitated DNA משמש לאחר מכן PCR כמותי לחקור את השפע ואת לוקליזציה של שינויים post-translational היסטון ברחבי הגנום.
Abstract
היסטון שינויים post-translational (PTMs), כגון acetylation, מתילציה זרחון, מוסדרים באופן דינאמי על ידי סדרה של אנזימים להוסיף או להסיר את הסימנים האלו בתגובה לאותות שהתקבלו על-ידי התא. PTMS אלה אנו רותמים את ויסות תהליכים כגון בקרת ביטוי גנים ותיקון דנ א. Immunoprecipitation כרומטין (chIP) כבר גישה אינסטרומנטלית ניקוד את השפע ואת לוקליזציה של PTMs היסטון רבים ברחבי הגנום בתגובה לפליטת מגוונים אל התא. . הנה, מתוארת שיטה רב-תכליתי לביצוע שבב של שינויים היסטוניים post-translationally ששונה מ שמרים ניצני האפייה (cerevisiae ס) . שיטה זו מתבססת על crosslinking של חלבונים ודנ א באמצעות טיפול פורמלדהיד שמרים תרבויות, דור של שמרים lysates מאת חרוז מכות, solubilization של כרומטין קטעים על ידי נוקלאז micrococcal, immunoprecipitation של היסטון-DNA מתחמי. DNA הקשורים עם הסימן היסטון עניין מטוהרים, שעבר ניתוח ה-PCR כמותי כדי להעריך את העשרת ב לוקוסים מרובות ברחבי הגנום. נציג ניסויים חיטוט הלוקליזציה של הסימנים היסטון H3K4me2, H4K16ac wildtype, שמרים מוטציה נידונות להפגין ניתוח נתונים ופרשנות. שיטה זו מתאימה למגוון רחב של היסטון PTMs ואת יכולה להתבצע עם זנים מוטציה או בנוכחות לחצים סביבתיים מגוונים, שהופך אותו כלי מצוין עבור חוקרים לשינויים כרומטין dynamics בתנאים שונים.
Introduction
השינוי post-translational דינמי (PTM) של שינויים היסטוניים הוא מנגנון רגולטורי מפתח עבור תהליכים תבניות DNA רבים, כולל תמלול, שכפול ה-DNA תיקון1,2. היכולת לקבוע את השפע ואת לוקליזציה מדויק של שינויים היסטוניים ששונה והמצוות בתהליכים אלה ולכן קריטי להבנת שלהם תקנה בתנאים שונים בתא. הפיתוח של כרומטין immunoprecipitation (chIP) כשיטה בעיקר נבעה מחקרים ביוכימיים של האינטראקציות של חלבונים עם ה-DNA, במיוחד במבחנה שיטות שימוש crosslinkers כימיים, בשילוב עם הצורך להעריך באופי הדינמי של חלבון-DNA אינטראקציות ויוו ועל אזורים ספציפיים של גנום3,4,5. קידום של ה-PCR כמותי (qPCR), טכנולוגיות רצף התרחב גם את היכולת לבצע ניסויים שבב עם השוואות כמותיים ועל -פני כל הגנום, שהופך אותו לכלי רב עוצמה לנתח אינטראקציות חלבון-דנ א- רמות מרובות.
כיום, השבב הוא שיטה נדרש עבור כל קבוצת המחקר מתעניין בתיווך כרומטין רגולציה של הגנום כפי ישנן שיטות דומות לא ישירות חוקר את הקשר הפיזי בין של היסטון ששונה מסוים גנומית לוקוס ב ויוו. למרות וריאציות של שיטה זו באמצעות רצף הדור הבא כדי למפות היסטון שינויים בכל רחבי הגנום6,7 זמינים, גישות אלה רשאי לפנות שאלות מדעיות שונות, קנה המידה שלהם, עלות והגבלת משאבים טכניים עלולה להיות לכמה קבוצות מחקר. בנוסף, יישוב שבב-qPCR יש צורך להשלים את אלה גישות על-ידי מתן שתי שיטות לייעל את פרוטוקול שבב לפני רצף וכדי לאמת תוצאות epigenomic datasets. ספקטרומטר מסה גישות מבוססות על זיהוי מגוון היסטון סימנים הקשורים עם אזורים גנומית יש גם הופיעו8,9,10,11, עם זאת, אלה גישות יש כמה מגבלות לגבי אשר אזורים בגנום פתור והן דורשות מומחיות טכנית ומכשור לא יהיה זמין כל קבוצות מחקר. לכן, שבב נשאר שיטה למעין לניתוח את השפע ואת ההפצה של היסטון שינויים בתנאים מגוונים עבור כל קבוצות מחקר אפיגנטיקה, כרומטין, ברגולציה של פונקציות גנומית.
כאן, אנו מתארים שיטה עבור השבב באמצעות שמרים ניצני דגם האפייה (cerevisiae ס) לחקור את ההפצה של היסטון PTMs-כרומטין. גישה זו נסמכת על מספר רכיבים מרכזיים של פרוטוקולים השבב פותח שמרים וחלים גם מודל מגוון מערכות12,13. אינטראקציות בין שינויים היסטוניים שונה ל- DNA בתא נשמרים על ידי crosslinking עם פורמלין. בעקבות הכנה lysate, שברי כרומטין solubilized לחלקים בגודל אחיד על ידי עיכול עם נוקלאז micrococcal. Immunoprecipitation של שינויים היסטוניים ששונה מתבצע באמצעות נוגדנים או מסחרי או שנוצרו על-ידי מעבדה, אנ-איי הוא מבודד וניתח העשרה על אזורים מסוימים גנומית באמצעות qPCR (איור 1). עבור שינויים רבים היסטון, כמות ה-DNA המתקבל פרוטוקול זה מספיקה לבדיקה יותר מ 25 לוקוסים גנומית שונים על ידי qPCR.
שיטה זו שבב היא רב תכליתי עבור ניטור ההתפלגות של שינוי היסטון יחיד על-פני מספר זנים מוטציה או תנאים סביבתיים, או לבדיקת שינויים מרובים היסטון בתאים wildtype במספר רב של לוקוסים גנומית. יתר על כן, רכיבים רבים של הפרוטוקול הם מתכוונן בקלות כדי למטב את זיהוי סימני מאוד – או נחות-בשפע גם היסטון. בסופו של דבר, מבצע שבב של שינויים היסטוניים ששונה ניצני שמרים מספק את ההזדמנות לשימוש בפקדים מפתח נוגדנים ירידה לפרטים שאינם זמינים בעיקר במערכות אחרות. כלומר, זני שמרים ניתן להפיק שנושאים מוטציות נקודה ב שאריות היסטון זה מיועדים להחלת השינוי, במקרים מסוימים, יש רק אנזים יחיד זה מזרז את השינוי על משקע היסטון מסוים (למשל-היסטון ליזין methyltransferases). לכן, שבב יכול להתבצע גם היסטון מוטציה או אנזים מחיקה זנים כדי assay במידה שאליו שאינם ספציפיים קשירה של הנוגדן עשוי להיות המתרחשים ותפיק תוצאות חיוביות שגויות. פקד זה חשובה במיוחד עבור פיתח נוגדנים, אפילו יכול לשמש כדי לאמת ירידה לפרטים נוגדנים עבור השינויים שנשמרת היסטון לפני השימוש במערכות אחרות. גישה זו משלימה שיטות אחרות כדי לבדוק נוגדנים ירידה לפרטים להבחין בין מדינות שונות שינוי (כגון מונו-, די – tri-מתילציה), לרבות חקירת מערכים של פפטידים ששונה וביצוע שהכלים המערבי של שינויים היסטוניים או נוקליאוזומים עם שינויים מוגדר. בסך הכל, לשבב ניצני שמרים היא שיטה חזקה עבור הערכת את הדינמיקה של היסטון PTMs ברחבי הגנום, לנתח את המנגנונים השולטים שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך המתואר כאן מאפשר התאוששות יעיל של DNA המשויכים ששונה שינויים היסטוניים בתאים שמרים על-ידי immunoprecipitation. זה מלווה qPCR באמצעות תחל אשר להגביר את האזורים עניין לקבוע העשרה המקומיים או דלדול של שינויים ספציפיים היסטון. למרות מפותח כשיטה לפני כמעט 20 שנה, שבב עדיין וזמינותו המכונן על חקירת מצב…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות חברי המעבדה ירוק לדיונים מועיל. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים NIH R03AG052018 ו- R01GM124342 כדי E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
Referências
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3′-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
