Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae
Summary
Aquí, describimos un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina de histonas modificadas de la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated ADN se utiliza posteriormente para PCR cuantitativa para interrogar la abundancia y localización de modificaciones post-traduccionales de las histonas por todo el genoma.
Abstract
Modificaciones post-traduccionales de las histonas (PTMs), como acetilación, metilación y fosforilación, dinámicamente son reguladas por una serie de enzimas que añadir o quitar estas marcas en respuesta a las señales recibidas por la célula. Estos MPa es principales contribuyentes a la regulación de procesos tales como control de expresión del gene y de reparación del ADN. Inmunoprecipitación de cromatina (chIP) ha sido un acercamiento instrumental para disección de la abundancia y la localización de muchos PTMs histonas por todo el genoma en respuesta a las diversas perturbaciones a la celda. Aquí, se describe un método versátil para la realización de chIP de modificación postraduccional histonas de la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) . Este método se basa en el entrecruzamiento de las proteínas y el ADN mediante tratamiento de formaldehído de las culturas de levadura, generación de lisados de levadura por cordón latiendo, solubilización de fragmentos de cromatina por nucleasa micrococcal e inmunoprecipitación de ADN histonas complejos. ADN asociado con la marca de la histona de interés es purificado y sometido a análisis PCR cuantitativo para evaluar su enriquecimiento en múltiples loci por todo el genoma. Experimentos representativos sondeo la localización de las marcas de histonas H3K4me2 y H4K16ac en wildtype y levadura mutada se discuten para demostrar la interpretación y análisis de datos. Este método es conveniente para una variedad de la histona PTMs y puede realizarse con diferentes cepas mutantes o en presencia de diversas presiones ambientales, lo que es una excelente herramienta para investigar cambios en la dinámica de la cromatina en condiciones diferentes.
Introduction
La modificación poste-de translación dinámica (PTM) de las histonas es un mecanismo regulador fundamental para muchos procesos con plantilla de ADN, incluyendo transcripción, replicación y reparación de ADN1,2. La capacidad para determinar la abundancia y la localización precisa de las histonas modificadas concomitantes con estos procesos por lo tanto es fundamental para entender la regulación bajo diferentes condiciones en la célula. El desarrollo de inmunoprecipitación de cromatina (chIP) como un método en gran parte provino de los estudios bioquímicos de las interacciones de proteínas con el ADN, particularmente en vitro métodos reticulantes químicos, junto con la necesidad de evaluar la carácter dinámico de las interacciones DNA proteína en vivo y en regiones específicas del genoma3,4,5. El avance de las tecnologías de secuenciación y la PCR cuantitativa (qPCR) también ha ampliado la capacidad para realizar experimentos de chIP con comparaciones cuantitativas y a través de genomas enteros, lo que es una herramienta poderosa para disecar las interacciones DNA-proteína en múltiples niveles.
Actualmente, la viruta es un método necesario para cualquier grupo de investigación interesado en la regulación de cromatina mediada del genoma como no existen métodos comparables para interrogar directamente el enlace físico entre una histona modificado y un locus genómico específico en vivo. Aunque existen variaciones de este método con secuencia de la generación siguiente a modificaciones de las histonas a lo largo del genoma6,7 , estos enfoques pueden abordar diversas cuestiones científicas y su escala, costo y recursos técnicos pueden ser limitantes para algunos grupos de investigación. Además, chIP-qPCR específica es necesario para complementar estos enfoques proporcionando métodos tanto optimización el protocolo de la viruta antes de iniciar la secuencia y validar los resultados de los conjuntos de datos epigenómica. Espectrometría de masas basado en enfoques para identificar el complemento completo de la histona marcas asociadas con regiones genómicas también han surgido8,9,10,11, sin embargo, estos enfoques tienen algunas limitaciones con respecto a qué regiones del genoma pueden ser sondeadas y requieren conocimientos técnicos y la instrumentación que no estará disponible para todos los grupos de investigación. Por lo tanto, el chIP sigue siendo un método fundamental para el análisis de la abundancia y la distribución de modificaciones de las histonas bajo diversas condiciones para todos los grupos de investigación interesados en epigenética, la cromatina y la regulación de funciones genómicas.
Aquí, describimos un método para modelo de chIP con la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) para investigar la distribución de PTMs histonas en la cromatina. Este enfoque se basa en una serie de componentes de la base de protocolos chIP desarrollado en la levadura y también se aplica a modelo diversos sistemas12,13. Las interacciones entre las histonas modificadas y ADN en la célula se conservan por entrecruzamiento con formaldehído. Tras preparación lisada, fragmentos de cromatina son solubilizados en fragmentos de tamaño uniformemente por digestión con nucleasa micrococcal. Inmunoprecipitación de las histonas modificadas se realiza con anticuerpos comerciales o generados por el laboratorio y cualquier ADN asociado es aislado y analizado para el enriquecimiento en determinadas regiones genomic usando qPCR (figura 1). Para muchas modificaciones de las histonas, la cantidad de ADN obtenido de este protocolo es suficiente para probar más de 25 diferentes loci genómicos por qPCR.
Este método de chIP es muy versátil para el control de la distribución de una modificación de las histonas solo a través de múltiples cepas mutantes o las condiciones ambientales, o para probar múltiples modificaciones de las histonas en las células de tipo salvaje en un número de loci genómicos. Además, numerosos componentes del protocolo son fácilmente ajustables para optimizar la detección de cualquiera de los dos altamente o humildes-abundantes marcas de histona. Finalmente, realizar chIP de histonas modificadas en levadura de florecimiento ofrece la oportunidad de utilizar los controles claves para especificidad de anticuerpos que no están ampliamente disponibles en otros sistemas. Es decir, se pueden generar cepas de levadura que llevan las mutaciones de punto en los residuos de las histonas que son objeto de modificación y, en algunos casos, existe solamente una sola enzima que cataliza un residuo particular histona modificación (ej. lisina de las histonas metiltransferasas). Por lo tanto, chIP puede realizarse en cualquiera de los dos las histona mutante o enzima eliminación cepas analizar la medida en que Unión inespecífica del anticuerpo se puede que ocurre y generar falsos positivos. Este control es particularmente valioso para los anticuerpos del recién desarrollado y puede incluso ser utilizado para validar la especificidad del anticuerpo por modificaciones de las histonas conservados antes de su uso en otros sistemas. Este enfoque complementa otros métodos para probar la especificidad del anticuerpo que distinguen entre Estados de modificación diferentes (por ejemplo, mono-, di – y tri-metilación), incluyendo matrices de péptidos modificados de sondeo y realizar western blot de las histonas o nucleosomas con modificaciones definidas. En general, chIP en levadura de florecimiento es un método eficaz para evaluar la dinámica de la histona MPa por todo el genoma y los mecanismos que regulan su regulación de disección.
Protocol
Representative Results
Discussion
El procedimiento aquí descrito permite la eficiente recuperación de ADN asociada con histonas modificadas en las células de levadura por la inmunoprecipitación. Esto es seguido por qPCR utilizando cebadores que amplifican regiones de interés para determinar el enriquecimiento local o el agotamiento de las modificaciones específicas de histonas. A pesar de ser desarrollado como un método hace casi 20 años, chIP sigue siendo el ensayo definitorio para investigar el estado de modificación de las histonas en diferen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a miembros del laboratorio verde para discusiones útiles. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de NIH R03AG052018 y R01GM124342 a E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
Referências
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