Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation der geänderten Histone aus der angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae. Immunoprecipitated DNA wird anschließend für die quantitative PCR verwendet, um die Fülle und die Lokalisierung von Histon post-translationalen Modifikationen während des Genoms zu befragen.
Abstract
Histon post-translationalen Modifikationen (PTMs), wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, sind dynamisch geregelt durch eine Reihe von Enzymen, die hinzufügen oder entfernen Sie diese Zeichen in Reaktion auf Signale, die von der Zelle. Diese PTMS sind wichtige Mitwirkende bei der Regulierung von Prozessen wie gen-Expressions und DNA zu reparieren. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine instrumentale Ansatz für sezieren die Fülle und die Lokalisierung von vielen Histon PTMs im gesamten Genom als Reaktion auf verschiedene Störungen in der Zelle gewesen. Hier ist eine vielseitige Methode zur Durchführung von ChIP posttranslational modifizierte Histone aus der angehende Hefe Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae) beschrieben. Diese Methode beruht auf der Vernetzung von Proteinen und DNA mit Formaldehyd Behandlung von Hefekulturen, Generierung von Hefe Lysates durch Wulst schlagen, Solubilisierung der Chromatin-Fragmente von micrococcal Nuklease und Immunopräzipitation der Histon-DNA -komplexe. DNA, verbunden mit dem Histon-Zeichen von Interesse ist gereinigt und quantitative PCR-Analysen, seine Anreicherung an mehrere Loci während des Genoms zu bewerten unterzogen. Repräsentative Experimente sondieren die Lokalisierung der Histon-Marken H3K4me2 und H4K16ac in Wildtyp und Mutanten Hefe werden diskutiert, um Datenanalyse und Interpretation zu demonstrieren. Diese Methode eignet sich für eine Vielzahl von Histon PTMs und kann mit verschiedenen mutierte Stämme oder in Gegenwart von verschiedenen Umweltbelastungen, so dass es ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung von Veränderungen in der Chromatin-Dynamik unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden.
Introduction
Die dynamische Post-translationale Modifikation (PTM) der Histone ist eine wichtige Regulationsmechanismus für viele DNA-templated Prozesse, einschließlich Transkription, Replikation und DNA-Reparatur1,2. Die Fähigkeit, die Fülle und die präzise Lokalisierung der geänderten Histone mit dieser Prozesse zu bestimmen ist daher entscheidend für ihre Verordnung unter verschiedenen Bedingungen in der Zelle zu verstehen. Die Entwicklung von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) als eine Methode weitgehend entstammte biochemische Untersuchungen der Interaktionen von Proteinen mit DNA, insbesondere in-vitro- Methoden mit chemischen Vernetzer, gepaart mit zu bewerten die Dynamik der Protein-DNA-Wechselwirkungen in Vivo und in bestimmten Regionen des Genoms3,4,5. Die Weiterentwicklung der quantitativen PCR (qPCR) und Sequenziertechnologien hat auch die Fähigkeit zur ChIP-Experimente mit quantitative Vergleiche und in ganzer Genome, so dass es ein leistungsfähiges Werkzeug für DNA-Protein Interaktionen zu sezieren erweitert. mehrere Ebenen.
Derzeit ist ChIP eine gewünschte Methode für jede Forschungsgruppe Chromatin-vermittelte Regulation des Genoms interessiert, da gibt es keine vergleichbaren Methoden für direkt befragen die physikalische Verbindung zwischen eine modifizierte Histon und einer spezifischen genomischen Locus in Vivo. Obwohl Variationen dieser Methode mit der Sequenzierung der nächsten Generation zuordnen Histon Änderungen im gesamten Genom6,7 verfügbar sind, können diese Ansätze richten verschiedene wissenschaftliche Fragestellungen und deren Umfang, Kosten und technische Ressourcen können für einige Forschungsgruppen zu begrenzen. Darüber hinaus gezielte ChIP-qPCR ist notwendig, diese ergänzen Ansätze durch die Bereitstellung von Methoden, um beide zu optimieren das ChIP-Protokoll vor der Sequenzierung und Ergebnisse aus der epigenomischen-Datasets zu validieren. Massenspektrometrie basierte Ansätze für identifizieren die volle Ergänzung von Histon Marken genomische Regionen zugeordnet auch haben8,9,10,11, doch tauchten diese Ansätze haben einige Einschränkungen in Bezug auf die Regionen des Genoms sondiert werden können und sie erfordern Fachwissen und Instrumentierung, die nicht zur Verfügung, um alle Forschungsgruppen werden. ChIP bleibt daher eine grundlegende Methode für die Analyse, die Fülle und den Vertrieb von Histon-Modifikationen unter unterschiedlichen Bedingungen für alle Forschungsgruppen Epigenetik, Chromatin und die Regulierung der genomischen Funktionen interessiert.
Hier beschreiben wir eine Methode für sein Modell die ChIP mit den angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae (S. Cerevisiae) um die Verteilung von Histon PTMs im Chromatin zu untersuchen. Dieser Ansatz stützt sich auf eine Reihe von Kernkomponenten des ChIP-Protokolle in Hefe entwickelt und galt auch für diverse Modell Systeme12,13. Wechselwirkungen zwischen geänderten Histone und DNA in der Zelle sind durch Vernetzung mit Formaldehyd konserviert. Nach lysate Vorbereitung sind Chromatin Fragmente in gleichmäßig große Fragmente durch Vergärung mit micrococcal Nuklease solubilisiert. Immunopräzipitation der geänderten Histone erfolgt mit kommerziellen oder Labor erzeugten Antikörper und alle damit verbundenen DNA isoliert und analysiert für die Anreicherung an bestimmten genomische Regionen mit qPCR (Abbildung 1). Für viele Histon-Modifikationen reicht die Menge an DNA erhalten aus diesem Protokoll mehr als 25 verschiedenen genomic Loci von qPCR getestet.
Diese ChIP-Methode ist sehr vielseitig für die Überwachung der Verteilung einer einzelnen Histon-Modifikation über mehrere mutierte Stämme oder Umweltbedingungen oder in Wildtyp-Zellen bei einer Reihe von genomic Loci zu Testzwecken mehrere Histon-Modifikationen. Darüber hinaus sind zahlreiche Komponenten des Protokolls leicht einstellbar, Erkennung von entweder hoch – oder niedrigen-reichlich vorhandene Histon-Marken zu optimieren. Schließlich bietet angehenden Hefe ChIP der geänderten Histone bei die Möglichkeit, wichtige Kontrollen für Antikörperbesonderheit, die weitgehend in andere Systeme nicht verfügbar sind. Nämlich Hefestämme erzeugt werden können, den Punktmutationen in Histon Rückstände zu tragen, die für eine Änderung ausgerichtet sind, und in einigen Fällen gibt es nur ein einziges Enzym, die Änderung auf einen bestimmten Histon-Rückstand katalysiert (zB. Histon Lysin Methyltransferasen). Daher kann ChIP durchgeführt werden, entweder die Histon Mutant oder Enzym Löschung Stämme, inwieweit assay auf die unspezifische Bindung des Antikörpers kann auftreten und falsch positive Ergebnisse generieren. Diese Kontrolle ist besonders wertvoll für die neu entwickelten Antikörper und kann auch verwendet werden, um Antikörper Spezifität für konservierte Histon Änderungen vor ihrer Verwendung in anderen Systemen zu überprüfen. Dieser Ansatz ergänzt andere Methoden um Antikörperbesonderheit zu testen, die Unterscheidung zwischen den verschiedenen Modifikation Staaten (z. B. Mono-, di- und Tri-Methylierung), einschließlich Sondierung Arrays modifizierte Peptide und westliche Flecken der Histone durchführen oder Nukleosomen mit definierten Modifikationen. Insgesamt ist ChIP in der angehenden Hefe eine leistungsfähige Methode für die Bewertung der Dynamik der Histon PTMs im gesamten Genom und sezieren die Mechanismen ihrer Regulierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die effiziente Gewinnung von DNA mit geänderten Histone in Hefezellen durch Immunopräzipitation verbunden. Dies wird gefolgt von qPCR mit Primer die Regionen von Interesse festzustellen, lokale Anreicherung oder Erschöpfung der spezifische Histon-Modifikationen zu verstärken. Trotz der vor fast 20 Jahren als eine Methode entwickelt, bleibt ChIP der entscheidende Test für die Untersuchung von Histon Änderungsstand an verschiedenen genomischen Regionen und unter unterschied…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten das grüne Labor für hilfreiche Gespräche danken. Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt von NIH-Stipendien, R03AG052018 und R01GM124342, E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
Referências
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