שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום
Summary
הליך זה הציג את refolding של התחום מחייב ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni chemoreceptor Tlp3 מן ההכללה וגופי הטיהור להניב כמויות מיליגרם של חלבון.
Abstract
זיהוי של ליגנדים טבעית של chemoreceptors ומחקרים מבניים מכוון הבהרה של הבסיס המולקולרי של ליגנד יחודיות ניתן להקל במידה רבה על ידי הייצור של כמויות מיליגרם של ליגנד טהור, מקופל מחייב תחומים. ניסיונות heterologously אקספרס ליגנד periplasmic דומיינים איגוד של חיידקי chemoreceptors ב Escherichia coli (e. coli) לעיתים קרובות התוצאה שלהם מיקוד לתוך גופות הכללה. . הנה, שיטה מוצג להתאוששות חלבון הכללה גופות, שלה refolding, טיהור, המחשבים איגוד ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni (ג jejuni) chemoreceptor Tlp3 כדוגמא. הגישה כרוך הביטוי של החלבון עניין עם cleavable שלו6-תג, בידוד, בתיווך אוריאה solubilisation של גופים הכללה, חלבון refolding על ידי דלדול שתנן, טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה ואחריו כרומטוגרפיה להסרת להדרה גודל תג. ספקטרוסקופיית קיווטות משמש כדי לאשר במצב מקופל של החלבון הטהור. זה הוכח, פרוטוקול זה שימושי בדרך כלל לייצור כמויות מיליגרם של dCACHE ליגנד periplasmic מחייב תחומים של אחרים chemoreceptors חיידקי בטופס מסיסים ו crystallisable.
Introduction
כימוטקסיס, תנועתיות הוכחו תפקיד חשוב בפתוגנזה קמפילובקטר jejuni באמצעות קידום colonisation חיידקי ופלישה של מארח1,2,3. כימוטקסיס מאפשרת לחיידקים לנוע לעבר סביבה אופטימלית עבור הצמיחה, המונחית על ידי אותות כימיים. תהליך זה דורש הכרה תאיים וסביבתיים סימנים כימיים על ידי קבוצה של חלבונים כינה chemoreceptors, או חלבונים דמויי מתמר (הניתוח). רוב chemoreceptors הם חלבונים ממברנה-מוטבע עם ליגנד extracytoplasmic מחייב תחום (LBD), תחום transmembrane, תחום האיתות cytoplasmic, הצופות על אינטראקציה עם החלבונים האיתות cytosolic המעבירים את האות מנועים השוטוניים4,5,6,7.
11 chemoreceptors שונים זוהו ב4,הגנום ג jejuni 8. עד כה, רק חלק chemoreceptors האלה יש אפיינה וידוע יחודיות ליגנד של Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712Tlp1113 . זיהוי של ליגנדים טבעית של chemoreceptors הנותרים של מין זה, chemoreceptors רבים של חיידקים אחרים, ניתן להקל במידה רבה על ידי הייצור של chemoreceptor רקומביננטי, מקופל וטהור מאוד LBDs14, 15 , 16. עם זאת, ניסיונות להביע heterologously את LBDs periplasmic של chemoreceptors חיידקי ב- Escherichia coli , לעיתים קרובות לגרום שלהם מיקוד לתוך גופות הכללה17,18,19 . למרות זאת, תופעה זו יכולה להקל על קל בידוד ושחזור של החלבון ביד. כאן, שיטה מוצג שחזור חלבון מגופים הכללה, refolding, טיהור, כדוגמא את LBD periplasmic של chemoreceptor ג jejuni Tlp3. דוגמה זו נבחרה משום Tlp3-LBD שייך משפחתי dCACHE20 של תחומים חישה המצויים בשפע שני היסטידין kinases ו chemoreceptors אאוקריוטים20,21, 22 , 23.
בגישה זו, הביטוי הבונה, בהתבסס על וקטור pET151/D-טופו, תוכנן לשלב N-מסוף שלו6-תג ואחריו טבק לחרוט וירוס (אס) פרוטאז המחשוף באתר, לקבלת תג עוקבות הסרת19. הפרוטוקול מתאר ביטוי חלבון ב e. coli, בידוד, בתיווך אוריאה solubilisation של הכללה, וגופי חלבון refolding על ידי דלדול אוריאה. בעקבות refolding, המדגם מטוהר באמצעות כרומטוגרפיית זיקה עם כרומטוגרפיה להסרת להדרה גודל תג אופציונלי. המדינה מקופלת של החלבון מזוכך הוא אישר באמצעות קיווטות ספקטרוסקופיה. זה גירסה שונה של השיטה פותחה בעבר כדי לשחזר ולטהר את LBD של chemoreceptor שונים, הליקובקטר פילורי TlpC19. הליך זה, המסוכם איור 1, מניב 10-20 מ”ג של Tlp3 טהור, לא מתויגות-LBD לכל 1 ליטר של התרבות חיידקי, עם חלבון טוהר > 90% כפי שנאמדו על ידי עמודים מרחביות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך פשוט ביטוי, refolding מגופים הכללה של LBD periplasmic של chemoreceptor חיידקי Tlp3 מוצג. הכנה של החלבון הטהור כרוך ביטוי יתר של הגן חיות מחמד פלסמיד-מקודד ב e. coli, טיהור, solubilisation של גופים הכללה, refolding של החלבון denatured, טיהור שלה על ידי בזיקה רצופים ו גודל-הדרה כרומטוגרפיה צעדים. הקלו אוריאה דנטורציה של דיל…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ליו יו ג על עבודותיו המוקדמות ההפקה Tlp3-LBD. עורכת דין אחינעם אורבך א מצ’וקה הוא מחויב המחלקה הבינלאומית Admistrativo דה Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS עבור מלגת הדוקטורט.
Materials
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ – C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
Referências
- Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
- Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
- Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
- Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R. Chemotaxis in Campylobacter jejuni. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (1), 24-31 (2012).
- Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
- Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
- Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
- Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
- Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
- Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822 (2014).
- Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
- Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
- Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206 (2016).
- McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
- Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
- Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
- Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
- Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862 (2016).
- Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
- Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
- Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
- Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
- Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
- Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
- Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
- Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Bioquímica. 4 (6), 1030-1036 (1965).
- Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
- Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
- Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11 (2004).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
- Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
- Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
- Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
- Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
- Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
- Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
- Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
- Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
- Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Bioquímica. 34 (17), 5773-5794 (1995).
