Metodo per ripiegamento efficiente e purificazione del chemocettore Ligand Binding Domain
Summary
Una procedura è presentata per il ripiegamento del dominio legante dCACHE periplasmico ligando di Campylobacter jejuni del chemocettore Tlp3 da corpi di inclusione e la purificazione per produrre quantità di milligrammo di proteina.
Abstract
Identificazione di ligandi naturali dei chemocettori e studi strutturali mirati a delucidazione delle basi molecolari della specificità ligando può essere notevolmente facilitata mediante la produzione di quantità di milligrammo di domini di legame del ligando puro, piegato. Tentativi di heterologously express domini di legame del ligando periplasmico di chemocettori batteriche in Escherichia coli (Escherichia coli) spesso provocare mirati nei corpi di inclusione. Qui, un metodo è presentato per recupero di proteina da corpi di inclusione, suo ripiegamento e purificazione, utilizzando il dominio di legame del ligando dCACHE periplasmico di jejuni del campilobatterio (c. jejuni) del chemocettore Tlp3 come esempio. L’approccio implica espressione della proteina di interesse con un spaccabili sua6-tag, isolamento e urea-mediata solubilizzazione dei corpi di inclusione, proteina ripiegamento di esaurimento dell’urea e la purificazione mediante cromatografia di affinità seguita da cromatografia di rimozione e di esclusione dimensionale di tag. La spettroscopia di dicroismo circolare viene utilizzata per confermare il ripiegamento della proteina pura. È stato dimostrato che questo protocollo è in genere utile per la produzione di quantità di milligrammo di domini di legame ligando periplasmico dCACHE di altri chemocettori batteriche in forma solubile e cristallizzabili.
Introduction
Chemiotassi e motilità hanno dimostrati di svolgere i ruoli importanti nella patogenesi di jejuni del campilobatterio promuovendo la colonizzazione batterica e l’invasione dei host1,2,3. Chemiotassi permette ai batteri di muoversi verso un ambiente ottimale per la crescita, come guidati da segnali chimici. Questo processo prevede il riconoscimento dei segnali chimici intracellulari ed ambientale da un insieme di proteine chiamati chemocettori, o simil-trasduttore (TLP). Maggior parte dei chemocettori sono proteine di membrana incorporato con un extracitoplasmatico ligando (LBD), un dominio transmembrana e un dominio citoplasmatico segnalazione, il secondo dei quali interagisce con le proteine citosoliche di segnalamento che trasmettono il segnale di associazione per i motori flagellari4,5,6,7.
Undici diverse chemocettori sono state identificate nel genoma di c. jejuni 4,8. Ad oggi, solo alcuni di questi chemocettori sono stati caratterizzati e la specificità di ligandi di Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712e Tlp1113 è noto. Identificazione di ligandi naturali i chemocettori rimanenti in questa specie, e numerosi chemiorecettori in altri batteri, può essere notevolmente facilitata mediante la produzione di piegato e altamente puro del chemocettore ricombinante LBDs14, 15 , 16. Tuttavia, tentativi di heterologously express periplasmico LBDs di chemocettori batteriche in Escherichia coli spesso causare mirati in corpi di inclusione17,18,19 . Tuttavia, questo fenomeno può facilitare facile isolamento e ripristino della proteina in mano. Qui, un metodo è presentato per recupero di proteina da corpi di inclusione, suo ripiegamento e purificazione, utilizzando la LBD periplasmico del chemocettore c. jejuni Tlp3 come esempio. Questo esempio è stato scelto perché Tlp3-LBD appartiene alla famiglia dCACHE20 di telerilevamento domini che si trovano abbondantemente in due-componente istidina chinasi e chemocettori in procarioti20,21, 22 , 23.
In questo approccio, il costrutto di espressione, basato su un vettore di pET151/D-TOPO, è stato progettato per incorporare un N-terminale sua6-tag seguito da un tabacco etch sito di clivaggio della proteasi virus (TEV), per successivi tag rimozione19. Il protocollo descrive la sovraespressione della proteina in e. coli, isolamento e solubilizzazione urea-mediata di corpi di inclusione e di proteina ripiegamento da svuotamento di urea. Seguito di ripiegamento, il campione viene purificato mediante cromatografia di affinità, con cromatografia di rimozione e di esclusione dimensionale tag facoltativo. Il ripiegamento della proteina purificata è confermato usando la spettroscopia di dicroismo circolare. Si tratta di una versione modificata del metodo che è stato precedentemente sviluppato per recuperare e purificare la LBD di un diverso del chemocettore, Helicobacter pylori KMCO19. Questa procedura, riassunta nella Figura 1, produce 10-20 mg di puro, senza tag Tlp3-LBD per 1 L di coltura batterica, con una purezza di proteina di > 90% come valutato da SDS-PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una procedura semplice per espressione e ripiegamento dai corpi di inclusione di LBD periplasmico della chemoreceptor batterica Tlp3 è presentata. Preparazione della proteina pura coinvolge sovra-espressione del gene codificato con animali-plasmide in Escherichia coli, la purificazione e la solubilizzazione dei corpi di inclusione, di ripiegamento della proteina denaturata e sua purificazione di affinità consecutivi e passaggi di cromatografia di esclusione dimensionale. La denaturazione dell’urea-facilitato e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Yu C. Liu per i suoi primi lavori sulla produzione Tlp3-LBD. Mayra A. Machuca è in debito con Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS per una borsa di dottorato.
Materials
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ – C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
Referências
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