Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio
Summary
Se presenta un procedimiento para el refolding el dCACHE periplasmic dominio obligatorio del ligand del jejuni del Campylobacter quimioreceptor Tlp3 de cuerpos de inclusión y de la purificación para producir cantidades de miligramos de proteína.
Abstract
Identificación de ligandos naturales de los quimioreceptores y estudios estructurales dirigidos a la aclaración de las bases moleculares de la especificidad del ligando puede facilitarse grandemente por la producción de cantidades del miligramo de dominios de unión a ligando pura, doblado. Intentos de expresar heterologously dominios de unión a ligando periplasmic de quimioreceptores bacterianos en Escherichia coli (e. coli) a menudo resultan en su focalización en los cuerpos de inclusión. Aquí, se presenta un método para la recuperación de proteínas de cuerpos de inclusión, refolding y purificación, mediante el dominio de enlace de ligando dCACHE periplasmic de Campylobacter jejuni (C. jejuni) quimioreceptor Tlp3 como ejemplo. El enfoque implica la expresión de la proteína de interés con un escindibles sus6-etiqueta, aislamiento y solubilización de urea-mediada de cuerpos de inclusión, refolding por agotamiento de la urea y purificación mediante cromatografía de afinidad, la proteína seguido por cromatografía de retiro y exclusión de tamaño de etiqueta. La espectroscopía de dicroísmo circular se utiliza para confirmar el estado plegado de la proteína pura. Se ha demostrado que este protocolo es generalmente útil para la producción de cantidades del miligramo de dominios de unión a ligando periplasmic dCACHE de otros quimiorreceptores bacterianas en forma soluble y cristalizables.
Introduction
Quimiotaxis y motilidad han demostrado que desempeñan papeles importantes en la patogénesis del jejuni del Campylobacter promoviendo la colonización bacteriana y la invasión de los host1,2,3. Quimiotaxis permite que las bacterias lograr un ambiente óptimo para el crecimiento, como guiados por señales químicas. Este proceso implica el reconocimiento de señales químicas intracelulares y ambientales por un conjunto de proteínas denominadas quimiorreceptores o transductor-como proteínas (Tlps). La mayoría quimioreceptores son proteínas embebido en la membrana con un extracytoplasmic ligando vinculante dominio (LBD), un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico de señalización, que interactúa con las proteínas de señalización citosólicas que transmiten la señal los motores flagelares4,5,6,7.
Once quimioreceptores diferentes se han identificado en el genoma de C. jejuni 4,8. Hasta la fecha, sólo algunos de estos quimioreceptores han sido caracterizados y se sabe la especificidad del ligando de Tlp19Tlp310,11, Tlp411, Tlp712y Tlp1113 . Identificación de ligandos naturales de los quimioreceptores restantes en esta especie y numerosos Quimioreceptores en otras bacterias, puede facilitarse grandemente por la producción de plegado y altamente puro recombinante quimioreceptor LBDs14, 15 , 16. sin embargo, los intentos de expresar heterologously periplasmic LBDs de quimioreceptores bacterianos en Escherichia coli a menudo resultan en su focalización en los cuerpos de inclusión17,18,19 . Sin embargo, este fenómeno puede facilitar la fácil aislamiento y recuperación de la proteína en la mano. Aquí, se presenta un método para recuperación de proteína de cuerpos de inclusión, refolding y purificación, con el LBD periplasmic de la C. jejuni quimioreceptor Tlp3 como ejemplo. Este ejemplo fue elegido porque Tlp3-LBD pertenece a la familia de dCACHE20 de dominios de detección que se encuentran abundantemente en dos componentes histidina quinasas y quimiorreceptores en procariotas20,21, 22 , 23.
En este enfoque, la construcción de la expresión, basada en un vector de pET151/D-TOPO, ha sido diseñada para incorporar un N-terminal su6-etiqueta seguida de un tabaco etch virus (TEV) proteasa escote sitio para etiqueta posterior retiro19. El protocolo describe la sobreexpresión de la proteína en e. coli, el aislamiento y la urea mediada la solubilización de los cuerpos de inclusión y la proteína refolding por agotamiento de la urea. Después refolding, la muestra se purifica mediante cromatografía de afinidad, con cromatografía de retiro y exclusión de tamaño de etiqueta opcional. El estado plegado de la proteína purificada se confirma mediante espectroscopía de dicroísmo circular. Esta es una versión modificada del método que se ha desarrollado anteriormente para recuperar y purificar el LBD de un quimioreceptor diferentes, Helicobacter pylori TlpC19. Este procedimiento, resumido en la figura 1, rinde 10 a 20 mg de puro, sin etiquetar Tlp3-LBD por 1 L de cultivo bacteriano, con una pureza de la proteína de > 90% estimados por SDS-PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un procedimiento sencillo para la expresión y refolding de cuerpos de inclusión de la LBD periplasmic del quimioreceptor bacteriana Tlp3. Preparación de la proteína pura implica la sobre expresión del gen pET plasmídico de e. coli, la purificación y la solubilización de los cuerpos de inclusión, refolding de la proteína desnaturalizada y su purificación por afinidad consecutiva y pasos de cromatografía por exclusión de tamaño. La desnaturalización facilitado por urea y dilución/diáli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias por sus primeros trabajos en la producción de LBD Tlp3 Yu C. Liu. Mayra A. Machuca está en deuda con Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS Beca doctoral.
Materials
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ – C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
Referências
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