JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Published: December 12, 2017
doi:
10.3791/57092
,
1Infection and Immunity Program,Monash Biomedicine Discovery Institute, 2Department of Microbiology,Monash University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology,Monash University

Summary

Bir yordam dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki dahil organları ve protein miligram miktarlarda verim için arıtma Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3, refolding için sunulmaktadır.

Abstract

Chemoreceptors ve yapısal çalışmaların ligand özgüllük moleküler temeli aydınlatma amaçlı doğal ligandlar tanımlaması büyük ölçüde saf, katlanmış ligand bağlayıcı etki alanları miligram miktarda üretim tarafından kolaylaştırılabilir. Heterologously periplasmic ligand bağlayıcı etki bakteriyel chemoreceptors Escherichia coli (e.coli) sık sık ifade etmek için girişimleri kendi dahil bedenlere hedefleme neden. Burada, bir yöntem dahil organları, onun refolding ve arıtma periplasmic dCACHE ligand bağlayıcı etki Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3, örnek olarak kullanarak, protein kurtarma için sunulmaktadır. Yaklaşım ifade ilgi ile bir yarilabilir protein içerir onun6-etiketi, yalıtım ve dahil organlarının solubilisation üre-aracılı protein üre tükenmesi ve arıtma benzeşme Kromatografi ile refolding etiketi kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi tarafından takip. Dairesel dichroism spektroskopisi saf protein katlanmış durumunu doğrulamak için kullanılır. Bu iletişim kuralı genellikle dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki alanından diğer bakteriyel chemoreceptors çözünür ve crystallisable miligram miktarda üretim için yararlıdır kanıtlanmıştır.

Introduction

Kemotaksis ve motilite bakteri kolonizasyonu ve ana bilgisayar1,2,3işgali teşvik ederek Campylobacter jejuni patogenezinde önemli rol oynamaya gösterilmiştir. Kemotaksis kimyasal sinyalleri tarafından güdümlü olarak bakteri büyüme için en iyi bir ortam doğru taşımak izin verir. Bu işlem chemoreceptors olarak adlandırdığı proteinler veya dönüştürücü gibi proteinler (TIPS) kümesi tarafından tanınması hücre içi ve çevresel kimyasal ipuçları içerir. Çoğu chemoreceptors proteinler membran katıştırılmış bağlayıcı etki alanı (yakın), bir transmembran ve ikincisi olan sinyal iletimi sitozolik sinyalizasyon proteinler ile etkileşim bir sitoplazmik sinyal verme etki alanı, bir extracytoplasmic ligand ile vardır kamçılı motorlar4,5,6,7.

Onbir farklı chemoreceptors C. jejuni genom4,8‘ tespit edilmiştir. Bugüne kadar bu chemoreceptors yalnızca bazılarını tanımlanabilecek ve Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712ve13 Tlp11 ligand özgüllük bilinmektedir. Bu türler içinde kalan chemoreceptors ve çok sayıda chemoreceptors diğer bakterilerde doğal ligandlar tanımlaması büyük ölçüde katlanmış ve son derece saf rekombinant chemoreceptor LBDs14, üretim tarafından kolaylaştırılabilir 15 , 16. ancak, girişimleri heterologously Escherichia coli bakteri chemoreceptors periplasmic LBDs sık sık ifade etmek için neden kendi dahil organları17,18,19 hedefleme . Yine de, bu olay kolay yalıtım ve kurtarma protein el kolaylaştırabilir. Burada, protein kurtarma dahil organları, refolding ve arıtma, C. jejuni chemoreceptor Tlp3 periplasmic yakın bir örnek olarak kullanarak bir yöntem sunulur. Çünkü, iki bileşenli histidin kinaz ve prokaryotlar20,21, chemoreceptors bol bol bulunan algılama etki alanlarının dCACHE aile20 Tlp3-yakın ait bu örnek seçildi 22 , 23.

Bu yaklaşım, pET151/D-TOPO vektör üzerinde alarak ifade inşa bir N-terminal onun6dahil etmek için dizayn edilmiştir-etiket bir tütün tarafından takip etch virüs (TEV) proteaz bölünme sitesi, sonraki etiketi kaldırma19. E. coli, yalıtım ve dahil organları ve üre tükenmesi tarafından refolding protein solubilisation üre-aracılı protein overexpression protokolünü açıklar. Refolding, aşağıdaki örnekte benzeşimi Kromatografi, isteğe bağlı etiket kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi ile tarafından saf. Saf protein katlanmış durumunu dairesel dichroism spektroskopisi kullanılarak doğrulanır. Bu daha önce yeniden elde etmek ve farklı bir chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19yakın arındırmak için geliştirilen yöntem değiştirilmiş bir sürümü var. Şekil 1‘ de özetlenmiştir bu yordamı, saf, etiketsiz Tlp3-yakın bakteri kültürü, 1 litre başına 10-20 mg protein saflığı verimleri > SDS-sayfa tarafından tahmini olarak % 90’ı.

Protocol

1. ifade onun6-Tlp3- E. coli yakın 150 mL steril Luria-Bertani (LB) suyu 50 µg mL-1 Ampisilin ile BL21-kodon-Plus (DE3) içeren aşılamak – RIPL hücreleri ile ifade onun6pET151/D-TOPO vektör dönüşüm – Tlp3-yakın (amino asit kalıntıları 42-291), ve Bu bir shaker (yörünge çapı, 25 mm) 37 ° C’de 200 d / gecede kuluçkaya. 800 mL steril LB suyu ve 50 µg mL-1 Ampisilin içeren altı 2 L Erlenmeyer şişe hazırlayın. Her şişesi 20 m…

Representative Results

Rekombinant ifade onun6-Tlp3- E. coli yakın protein ifade dahil organlarında sonuçlandı. Onun6yaklaşık 100 mg 1 l bakteri kültürü 2,13 adımda hesaplanan ifade verim yapıldı-Tlp3-yakın dahil gövdelerinde yatırılır. Burada açıklanan ve şekil 1′ de, resimli protein yalıtım, solubilisation dahil organları, protein refolding ve arıtma, benzeşim Kromatografi, etiketi kaldırma ve boyutu-dışlama Kromatografi …

Discussion

İfade ve bakteriyel chemoreceptor Tlp3 periplasmic yakın dahil vücutlarından refolding için basit bir yordam sunulur. Saf protein hazırlanması içerir E. coli, arıtma ve solubilisation dahil organlarının evde beslenen hayvan-plazmid kodlu genin aşırı ifade denatüre protein ve onun arıtma ardışık benzeşimi tarafından refolding ve Boyut-dışlama Kromatografi adımları. Denatürasyon üre kolaylaştırdı ve seyreltme/diyaliz-aracılı refolding protokolündeki optimizasyonu hangi kez dahil or…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yu C. Liu Tlp3-yakın üretim üzerine erken çalışmaları için teşekkür ediyoruz. Mayra A. Machuca Paraguay Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS doktora burs için borçlu.

Materials

Tris base AMRESCO 497
Sodium chloride (NaCl) MERK MILLIPORE 1064041000
Ampicillin G-BIOSCIENCES A051-B
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)  MERCK 52332
Triton x-100 AMRESCO 694
Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD AST0487
Urea AMRESCO VWRC0568
Dithiothreitol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD C-1029
L-arginine monohydrochloride SIGMA-ALDRICH A5131
Reduced L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4251
Oxidized L-glutathione SIGMA-ALDRICH G4376
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) SIGMA-ALDRICH  7558-79-4
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) SIGMA-ALDRICH 10049-21-5
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) AMRESCO VWRC20302.260
Imidazole SIGMA-ALDRICH I2399
Glycerol ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD BIOGB0232
Nickel chloride (NiCl2) SIGMA-ALDRICH 339350
Glycine AMRESCO VWRC0167
Sodium dodecyl sulfate (SDS) SIGMA-ALDRICH L4509
Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) NEW ENGLAND BIOLABS P7703
Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) MERCK UFC901096
50 mL Falcon tube FALCON BDAA352070
Dialysis tubing LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY Dialysis
Snakeskin dialysis tubing THERMO SCIENTIFIC™ 68100
Prepacked HiTrap Chelating HP column GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 17-0408-01 
EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser AVESTIN EmulsiFlex™ – C5
Peristaltic Pump P-1 GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 18-1110-91 
Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column  GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES 28989336
JASCO J-815 spectropolarimeter JASCO J-815
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  2. Josenhans, C., Suerbaum, S. The role of motility as a virulence factor in bacteria. Int J Med Microbiol. 291 (8), 605-614 (2002).
  3. Morooka, T., Umeda, A., Amako, K. Motility as an intestinal colonization factor for Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol. 131 (8), 1973-1980 (1985).
  4. Zautner, A. E., Tareen, A. M., Gross, U., Lugert, R. Chemotaxis in Campylobacter jejuni. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (1), 24-31 (2012).
  5. Zhulin, I. B. The superfamily of chemotaxis transducers: from physiology to genomics and back. Adv Microb Physiol. 45, 157-198 (2001).
  6. Fernando, U., Biswas, D., Allan, B., Willson, P., Potter, A. A. Influence of Campylobacter jejuni fliA, rpoN and flgK genes on colonization of the chicken gut. Int J Food Microbiol. 118 (2), 194-200 (2007).
  7. Salah Ud-Din, A. I., Roujeinikova, A. Methyl-accepting chemotaxis proteins: a core sensing element in prokaryotes and archaea. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  8. Parkhill, J., et al. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature. 403 (6770), 665-668 (2000).
  9. Hartley-Tassell, L. E., et al. Identification and characterization of the aspartate chemosensory receptor of Campylobacter jejuni. Mol Microbiol. 75 (3), 710-730 (2010).
  10. Rahman, H., et al. Characterisation of a multi-ligand binding chemoreceptor CcmL (Tlp3) of Campylobacter jejuni. PLoS Pathog. 10 (1), e1003822 (2014).
  11. Li, Z., et al. Methyl-accepting chemotaxis proteins 3 and 4 are responsible for Campylobacter jejuni chemotaxis and jejuna colonization in mice in response to sodium deoxycholate. J Med Microbiol. 63 (Pt 3), 343-354 (2014).
  12. Tareen, A. M., Dasti, J. I., Zautner, A. E., Gross, U., Lugert, R. Campylobacter jejuni proteins Cj0952c and Cj0951c affect chemotactic behaviour towards formic acid and are important for invasion of host cells. Microbiology. 156 (Pt 10), 3123-3135 (2010).
  13. Day, C. J., et al. A direct-sensing galactose chemoreceptor recently evolved in invasive strains of Campylobacter jejuni. Nat Commun. 7, 13206 (2016).
  14. McKellar, J. L., Minnell, J. J., Gerth, M. L. A high-throughput screen for ligand binding reveals the specificities of three amino acid chemoreceptors from Pseudomonas syringae pv. actinidiae. Mol. Microbiol. 96 (4), 694-707 (2015).
  15. Fernandez, M., Morel, B., Corral-Lugo, A., Krell, T. Identification of a chemoreceptor that specifically mediates chemotaxis toward metabolizable purine derivatives. Mol. Microbiol. 99 (1), 34-42 (2016).
  16. Corral-Lugo, A., et al. Assessment of the contribution of chemoreceptor-based signaling to biofilm formation. Environ. Microbiol. , (2015).
  17. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Cloning, expression, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for aspartate A (CcaA). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 1), 110-113 (2015).
  18. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Roujeinikova, A. Cloning, refolding, purification and preliminary crystallographic analysis of the sensory domain of the Campylobacter chemoreceptor for multiple ligands (CcmL). Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 71 (Pt 2), 211-216 (2015).
  19. Liu, Y. C., Roujeinikova, A. Expression, refolding, purification and crystallization of the sensory domain of the TlpC chemoreceptor from Helicobacter pylori for structural studies. Protein Expr. Purif. 107, 29-34 (2015).
  20. Upadhyay, A. A., Fleetwood, A. D., Adebali, O., Finn, R. D., Zhulin, I. B. Cache Domains That are Homologous to, but Different from PAS Domains Comprise the Largest Superfamily of Extracellular Sensors in Prokaryotes. PLoS Comput. Biol. 12 (4), e1004862 (2016).
  21. Bardy, S. L., Briegel, A., Rainville, S., Krell, T. Recent advances and future prospects in bacterial and archaeal locomotion and signal transduction. J. Bacteriol. , (2017).
  22. Glekas, G. D., et al. The Bacillus subtilis chemoreceptor McpC senses multiple ligands using two discrete mechanisms. J. Biol. Chem. 287 (47), 39412-39418 (2012).
  23. Liu, Y. C., Machuca, M. A., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. Structural basis for amino-acid recognition and transmembrane signalling by tandem Per-Arnt-Sim (tandem PAS) chemoreceptor sensory domains. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 10), 2127-2136 (2015).
  24. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  25. Whitmore, L., Wallace, B. A. Protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopy: methods and reference databases. Biopolymers. 89 (5), 392-400 (2008).
  26. Singh, S. M., Panda, A. K. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins. J Biosci Bioeng. 99 (4), 303-310 (2005).
  27. Lippincott, J., Apostol, I. Carbamylation of cysteine: a potential artifact in peptide mapping of hemoglobins in the presence of urea. Anal Biochem. 267 (1), 57-64 (1999).
  28. Cejka, J., Vodrazka, Z., Salak, J. Carbamylation of globin in electrophoresis and chromatography in the presence of urea. Biochim Biophys Acta. 154 (3), 589-591 (1968).
  29. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  30. Hagel, P., Gerding, J. J., Fieggen, W., Bloemendal, H. Cyanate formation in solutions of urea. I. Calculation of cyanate concentrations at different temperature and pH. Biochim Biophys Acta. 243 (3), 366-373 (1971).
  31. Volkin, D. B., Mach, H., Middaugh, C. R. Degradative covalent reactions important to protein stability. Mol Biotechnol. 8 (2), 105-122 (1997).
  32. Stark, G. R. Reactions of cyanate with functional groups of proteins. 3. Reactions with amino and carboxyl groups. Bioquímica. 4 (6), 1030-1036 (1965).
  33. Lin, M. F., Williams, C., Murray, M. V., Conn, G., Ropp, P. A. Ion chromatographic quantification of cyanate in urea solutions: estimation of the efficiency of cyanate scavengers for use in recombinant protein manufacturing. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 803 (2), 353-362 (2004).
  34. Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol Bioeng. 41 (1), 3-13 (1993).
  35. Vallejo, L. F., Rinas, U. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb Cell Fact. 3 (1), 11 (2004).
  36. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expr Purif. 3 (4), 263-281 (1992).
  37. Bornhorst, J. A., Falke, J. J. Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol. 326, 245-254 (2000).
  38. Stulik, K., Pacakova, V., Ticha, M. Some potentialities and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography. J Biochem Biophys Methods. 56 (1-3), 1-13 (2003).
  39. Kunji, E. R., Harding, M., Butler, P. J., Akamine, P. Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography. Methods. 46 (2), 62-72 (2008).
  40. Folta-Stogniew, E. Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors. Methods Mol Biol. 328, 97-112 (2006).
  41. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11 (9), 2067-2079 (2002).
  42. Machuca, M. A., Liu, Y. C., Beckham, S. A., Gunzburg, M. J., Roujeinikova, A. The Crystal Structure of the Tandem-PAS Sensing Domain of Campylobacter jejuni Chemoreceptor Tlp1 Suggests Indirect Mechanism of Ligand Recognition. J. Struct. Biol. 194 (2), 205-213 (2016).
  43. Rico-Jimenez, M., et al. Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis towards protein amino acids and the non-protein amino acid gamma-aminobutyrate. Mol. Microbiol. 88 (6), 1230-1243 (2013).
  44. Salah Ud-Din, A. I. M., Roujeinikova, A. The periplasmic sensing domain of Pseudomonas fluorescens chemotactic transducer of amino acids type B (CtaB): Cloning, refolding, purification, crystallization, and X-ray crystallographic analysis. Biosci. Trends. 11 (2), 229-234 (2017).
  45. Stockel, J., Doring, K., Malotka, J., Jahnig, F., Dornmair, K. Pathway of detergent-mediated and peptide ligand-mediated refolding of heterodimeric class II major histocompatibility complex (MHC) molecules. Eur J Biochem. 248 (3), 684-691 (1997).
  46. Cardamone, M., Puri, N. K., Brandon, M. R. Comparing the refolding and reoxidation of recombinant porcine growth hormone from a urea denatured state and from Escherichia coli inclusion bodies. Bioquímica. 34 (17), 5773-5794 (1995).

Tags

Keywords: ChemoreceptorLigand Binding DomainRefoldingPurificationInclusion BodiesE. ColiProtein ExpressionIPTG InductionCell LysisHomogenizationCentrifugationSDS-PAGEBuffer ExchangeSolubilizationProtein Purification
check_url/pt/57092?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Machuca, M. A., Roujeinikova, A. Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain. J. Vis. Exp. (130), e57092, doi:10.3791/57092 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image