Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne
Summary
Eine Prozedur wird vorgestellt, für die Umfaltung der dCACHE periplasmatischen Liganden-bindende Domäne von Campylobacter Jejuni Chemorezeptor Tlp3 Einschlusskörperchen und die Reinigung zu Milligramm-Mengen des Proteins führen.
Abstract
Identifizierung von natürlichen Liganden der Chemorezeptoren und strukturelle Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Grundlagen der Liganden Besonderheit kann durch die Produktion von Milligramm-Mengen rein, gefalteten Ligand verbindliche Domains erheblich erleichtert. Versuche heterologously periplasmatischen Ligand verbindliche Domänen der bakteriellen Chemorezeptoren in Escherichia coli (E. Coli) oft zum Ausdruck bringen, führen ihre Ausrichtung in Einschlusskörperchen. Hier ist eine Methode zur Proteingewinnung aus Einschlusskörperchen, die Umfaltung und Reinigung, mit den periplasmatischen dCACHE Liganden-bindende Domäne von Campylobacter Jejuni (C. Jejuni) Chemorezeptor Tlp3 als Beispiel vorgestellt. Der Ansatz beinhaltet Expression des Proteins des Interesses mit einem spaltbaren seiner6-Tag, Isolation und Harnstoff-vermittelten Lutensol von Einschlusskörperchen, Protein Umfaltung von Harnstoff Entleerung und Reinigung durch Affinitätschromatographie, gefolgt von Tag-Entfernung und Größe-Ausschluss-Chromatographie. Die kreisförmigen Dichroismus Spektroskopie wird verwendet, um die gefalteten Zustand des reinen Proteins zu bestätigen. Es hat sich gezeigt, dass dieses Protokoll in der Regel nützlich für die Produktion von Milligramm-Mengen dCACHE periplasmatischen Ligand verbindliche Domains von anderen bakteriellen Chemorezeptoren in eine lösliche und kristallisierbaren Form.
Introduction
Chemotaxis und Motilität haben gezeigt, eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Campylobacter Jejuni spielen, durch die Förderung der bakteriellen Besiedelung und Invasion der Host1,2,3. Chemotaxis ermöglicht Bakterien ein optimales Umfeld für Wachstum, Richtung, wie durch chemische Signale geführt. Dieser Prozess beinhaltet die Anerkennung der intrazellulären und Umwelt chemische Signale durch eine Reihe von Proteinen bezeichnet Chemorezeptoren oder Wandler-ähnliche Proteine (Tlps). Die meisten Chemorezeptoren sind Membran eingebettet Proteine mit einer extracytoplasmic Liganden-bindende Domäne (LBD), eine transmembrane Domäne und einer zytoplasmatischen Signal Domäne, von denen die letztere mit der cytosolischen Signalisierungen Proteinen interagiert, die Übertragung des Signals die flagellar Motoren4,5,6,7.
Elf verschiedene Chemorezeptoren wurden in der C. Jejuni Genom4,8identifiziert. Bisher haben nur einige der diese Chemorezeptoren geprägt und Liganden Spezifität der Tlp19Tlp310,11, Tlp411, Tlp712und Tlp1113 ist bekannt. Identifizierung von natürlichen Liganden der verbleibenden Chemorezeptoren in dieser Spezies und zahlreiche Chemorezeptoren in andere Bakterien kann erheblich erleichtert werden, durch die Produktion von gefalteten und hochreinen rekombinante Chemorezeptor Weihnachtskleidern14, 15 , 16. jedoch Versuche, heterologously periplasmatischen Weihnachtskleidern der bakteriellen Chemorezeptoren in Escherichia coli oft ausdrücken führen ihre Ausrichtung in Einschlusskörperchen17,18,19 . Dennoch kann dieses Phänomen einfach Isolierung und Wiederherstellung des Proteins in der hand erleichtern. Hier ist eine Methode zur Proteingewinnung aus Einschlusskörperchen, die Umfaltung und Reinigung, mit der periplasmatischen LBD von C. Jejuni Chemorezeptor Tlp3 als Beispiel vorgestellt. In diesem Beispiel wurde gewählt, weil Tlp3-LBD dCACHE Familie20 Fernerkundung Domains gehört, die reichlich in Zweikomponenten-Histidin-Kinasen und Chemorezeptoren in Prokaryoten20,21, gefunden werden 22 , 23.
Bei diesem Ansatz der Ausdruck Konstrukt, basierend auf einem pET151/D-TOPO-Vektor wurde entwickelt, um eine N-terminale seiner6integrieren-Tag, gefolgt von einem Tabak Ätzen Virus (TEV) Protease Spaltstelle für nachfolgende Tag Entfernung19. Das Protokoll beschreibt Protein Überexpression in E. Coli, Isolation und Harnstoff-vermittelten Lutensol Einschlusskörperchen und Protein Umfaltung durch Harnstoff-Depletion. Anschluss an Umfaltung, die Probe wird durch Affinitätschromatographie mit optionales Tag Entfernung und Größe-Ausgrenzung Chromatographie gereinigt. Die gefaltete Zustand des gereinigten Proteins ist mit kreisförmigen Dichroismus Spektroskopie bestätigt. Dies ist eine modifizierte Version der Methode, die bisher entwickelt wurde, um zu erholen und Reinigen der LBD eine unterschiedliche Chemorezeptor, Helicobacter Pylori TlpC19. Dieses Verfahren, die in Abbildung 1zusammengefasst ergibt 10-20 mg rein, untagged Tlp3-LBD pro 1 L der bakteriellen Kultur mit einer Protein-Reinheit von > 90 % als geschätzt durch SDS-PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein einfaches Verfahren für Ausdruck und Umfaltung von Einschlusskörperchen der periplasmatischen LBD der bakteriellen Chemorezeptor Tlp3 wird vorgestellt. Vorbereitung des reinen Proteins beinhaltet Überexpression des Gens Haustier-Plasmid-encoded in E. Coli, Reinigung und Lutensol Einschlusskörperchen, Umfaltung des denaturierten Proteins und dessen Reinigung durch die aufeinander folgenden Affinität und Größe-Ausschluss Chromatographie Schritte. Die Harnstoff-erleichtert Denaturierung und Verdünnung/D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Yu C. Liu für seine frühen Arbeiten auf der Tlp3-LBD-Produktion. Mayra A. Machuca ist verpflichtet, Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS für ein Promotionsstipendium.
Materials
| Tris base | AMRESCO | 497 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MERK MILLIPORE | 1064041000 | |
| Ampicillin | G-BIOSCIENCES | A051-B | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MERCK | 52332 | |
| Triton x-100 | AMRESCO | 694 | |
| Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | AST0487 | |
| Urea | AMRESCO | VWRC0568 | |
| Dithiothreitol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | C-1029 | |
| L-arginine monohydrochloride | SIGMA-ALDRICH | A5131 | |
| Reduced L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4251 | |
| Oxidized L-glutathione | SIGMA-ALDRICH | G4376 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | SIGMA-ALDRICH | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | SIGMA-ALDRICH | 10049-21-5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate (EDTA) | AMRESCO | VWRC20302.260 | |
| Imidazole | SIGMA-ALDRICH | I2399 | |
| Glycerol | ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD | BIOGB0232 | |
| Nickel chloride (NiCl2) | SIGMA-ALDRICH | 339350 | |
| Glycine | AMRESCO | VWRC0167 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | SIGMA-ALDRICH | L4509 | |
| Unstained Protein Ladder, Broad Range (10-250 kDa) | NEW ENGLAND BIOLABS | P7703 | |
| Amicon Ultracel centrifugal concentrator (Millipore) | MERCK | UFC901096 | |
| 50 mL Falcon tube | FALCON | BDAA352070 | |
| Dialysis tubing | LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY | Dialysis | |
| Snakeskin dialysis tubing | THERMO SCIENTIFIC™ | 68100 | |
| Prepacked HiTrap Chelating HP column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 17-0408-01 | |
| EmulsiFlex-C5 high-pressure homogeniser | AVESTIN | EmulsiFlex™ – C5 | |
| Peristaltic Pump P-1 | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 18-1110-91 | |
| Superdex 200 HiLoad 26/60 size-exclusion column | GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES | 28989336 | |
| JASCO J-815 spectropolarimeter | JASCO | J-815 |
Referências
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