Summary
구가 외 인 산화 상태는 말라 바인딩 단백질 girdin 티로신 1798 (pY1798)에 phosphorylated에 대 한 특정 항 체 술 셀 (TCs)을 사용할 수 있습니다 발견. 이 프로토콜의 부동성 공장 cryosections pY1798 항 체와 immunofluorescent 얼룩을 사용 하 여 TCs의 강력한 시각화 수 있습니다.
Abstract
말라 바인딩 단백질 girdin 걸 다양 한 조직에 셀 이동 하는 리 모델링에 필요한 cytosolic 단백질 이다. Girdin 수용 체와 티로신 1798에서 비 수용 체 티로신 kinases phosphorylated입니다. 오모리 연구진이 개발 사이트 및 인 산화 상태 특정 항 체 티로신-1798 (pY1798)에서 인간 girdin에 대하여 특히 묶는 phosphorylated 티로신-1798, 하지만 하지 unphosphorylated 티로신-1798. pY1798 항 체 특히 술 셀 (TCs) 포유류 위장 조직에 존재 하는 레이블을 사용 되었습니다 하지만 이러한 세포의 기능을 명확 하지 않다. 이 프로토콜에는 pY1798 항 체와 면역 형광을 사용 하 여 공장에서 TCs의 강력한 시각화 수 있습니다. 성공적이 고 간단한 TC 시각화를 위해이 프로토콜 포함 2 개의 조직학 기술: 젤라틴 가득 공장 조직, 그리고 3 헤와 공장 작성 50 ° C에서 저온 항 원 복구에서 자유 롭 뜨 cryosections의 생산 저온 항 원 복구 TCs이이 프로토콜의 성공적인 사용 pY1798 모 끝에서 배포 하는 TCs의 얼룩에 결과에서 강력한 신호를 보장 하는 반면 젤라틴 얼룩 절차에 걸쳐 무료-부동 섹션의 모양 유지 토 굴입니다. 얼룩진된 TCs 스풀 모양 소마와 형광 신호 튀어나온 '술.'에 해당 하는 lumenal 끝에 응축 Phalloidin 얼룩 두꺼워 솔 국경에 pY1798-긍정적인 TCs와 colocalized 고 TC 술에서 연장 rootlet 질량에 해당 합니다. 위장 내 시경으로 수집 하는 인간의 생 샘플에서 TCs 검사이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 또한, TCs 최근 알려졌다 쥐, 기생충 감염에 따라 축적이 프로토콜 인간의 창 자에서 기생충 감염의 진단에 대 한 응용 프로그램을 할 수 제안.
Introduction
술 셀 (TCs)는 꼭대기 tufts 및 스풀 모양 somas1특징은 위장 epithelia의 사소한 흩어져 요소입니다. TCs 처음 19562에 설명 했다, 비록 TC 기능은 부분적으로 신뢰할 수 있는 TC 마커의 부족 불분명 남아 있습니다.
에노모토 외. 먼저 girdin3, 혈관, 심장 판 막, 힘 줄, 그리고 골격 근육4같은 비 신경 조직에서 뿐만 아니라 신 경계 표현 말라 바인딩 단백질 특징. Girdin의 유전 제거와 쥐 성장 지체와 여러 뇌 변칙4,,56을 표시합니다. 한편, 손실의 기능 돌연변이 인간 girdin에 진보적인 뇌 질환, 심한 지체, 및 이른 개시 간 질 발작7와 연결 됩니다.
2011 년에 린 외. 티로신 tyrosine kinases EGFR 및 Src8등으로 중재 하는 1798에서 girdin의 동적 인 산화 발견. 그들은 또한 phosphorylated girdin 셀 마이그레이션8트리거를 개장 하는 걸 필요는 보여주었다. 오모리 연구진이 개발 사이트-그리고 인 산화 상태 특정 항 체에 대 한 인간의 girdin 티로신 1798 (pY1798 항 체) 고토의 프로토콜 다음에 phosphorylated 사이트 감독 mutagenesis의를 사용 하 여 항 체 확인 식 운반 전체 길이 girdin9,10벡터 스 2017 년, 구가 외. 그 pY1798는 높은 특이성 및 높은 감도1TCs 라벨을 보고 했다. PY1798 항 체는 우수한 착 색 속성을 밝혀 아직 특성 lumenal 끝에 ' 술'을 포함 하 여 전체 셀 모양 girdin의 생물학적 역할 기반 이전 TC 표식에 우수한 고 tc에서 인 girdin를 표시 했다 함수에는 불분명 한1남아 있었다.
이 연구에서 설명 하는 방법을 포함 한다 얼룩, 조직학 기술 표시 대상 단백질에 대 한 1 차적인 항 체와 형광 활용 된 이차 항 체에 대 한 기본 사용 하 여 조직에서 특정 단백질에 면역 형광 검사를 항 체입니다. 이 방법의 목적은 높은 품질 TC 이미지를 얻기 위해 조직학 경험 연구 수 있도록입니다. 이 프로토콜은 부동성 cryosections cryosections 슬라이드 마운트에 대 한 필요 또는 파라핀 섹션을 사용 합니다. 그러나, 무료-부동 섹션은 깨지기 쉬운 유리 슬라이드에서 지원의 부재로 인해 고 섹션 두께 항 체 침투성을 줄일 수 있습니다. 이 프로토콜 포함 되어 이러한 문제를 극복 하는 두 가지 방법: 1) 얼룩 절차에 걸쳐 무료-부동 섹션의 형태를 보존 하는 젤라틴과 전체 공장 루멘 작성 및 저온 항 원 검색을 사용 하 여 2) pY1798 신호를 강화.
Protocol
여기에 설명 된 모든 방법 동물 관리 및 사용 발달 연구, 아이치 휴먼 서비스 센터에 대 한 연구소의 위원회에 의해 승인 되었다 (출원 번호: M-03).
1입니다. 준비
- 10 L 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 준비: 32.27 g Na2HPO4·12H2O, NaH2포4·2H2O, 4.5 g의 NaCl의 80.0 g 실 온 (RT)에서 10 L. 저장소 솔루션의 최종 볼륨을 초순에 추가.
- PBS-t: 200 mL의 PBS의 단계 1.1에서에서 polyoxyethylene(10) octylphenyl 에테르의 100 µ L 0.05% (vol:vol)의 최종 농도에 200ml를 준비 합니다. 실시간에 저장소
- 장갑과 눈 보호를 입고, 하는 동안 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 15% 자당의 50 mL 준비: 자당 10%에 추가의 7.5 g을 50 mL의 최종 볼륨 중성 포 르 말린 솔루션 (자료 테이블) 버퍼링. 실시간에 저장소
주의: 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 포름알데히드와 흡입 또는 피부 또는 눈 접촉 위험 수 있습니다. 신중 하 게 처리 합니다. - 200 단위/mL phalloidin 형광 염료 어원이 재고 솔루션의 1.5 mL를 준비: phalloidin 형광 염료 켤레 (1 유리병, 동결 건조 된 고체, 여기 및 방출 파장 300 단위: 581 및 609 nm, 각각)의 1.5 mL에 메탄올입니다. -20 ° c.에 어둠 속에서 저장소 솔루션
- 준비 5 mg/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 재고 솔루션: N, N-dimethylformamide (DMF) 2 mL에 DAPI 10 밀리 그램. -20 ° c.에 어둠 속에서 저장소 솔루션
- 5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에서 준비: 0.5 g, BSA의 PBS의 10 mL. 4 ° c.에 게
- 집게를 사용 하 여 18-게이지 바로 바늘의 경사진된 끝을 제거 하 고 액체 바늘 루멘 (그림 1A1)을 통해 흐름을 수 있도록 세로 방향으로 핀 처와 물린된 끝을 꼬집어.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
2. 동물 해 부와 공장의 절연
- 마우스의 관류 고정
- 장갑을 착용 하 고 통풍이 잘되는 지역에서 작동.
- 100 mL 유리 비 커를 준비, 10% 중성 포 르 말린 솔루션, 수술 도구 (가 위, 집게), 금속 트레이 버퍼링, 6-0 나일론 봉합, 1.7, 같이 준비 18 게이지 바로 바늘 22 게이지 날개 달린된 바늘, 20 mL 주사기.
- 20 mL 주사기에 유리 비 커에서 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액 20 mL를 로드 하 고 콘센트에 연결할 22 게이지 날개 달린된 바늘.
- 50 mL 원심 분리기 튜브에서의 PBS (최종 5% 젤라틴) 20 mL에 젤라틴 가루 1 g을 추가 하 여 액체 젤라틴을 준비 합니다. RT에 15 분 동안 몸을 담근 채, 후 동요 없이 15 분 동안 물 목욕에서 50 ° C에서 품 어.
- 짧게 소용돌이, 그리고 또 다른 15 분 완전히 젤라틴 분해 50 ° C에서 품 어. 사용까지 RT에 튜브를 둡니다.
- 자 궁 경부 전위에 의해 성인 마우스를 안락사.
- 금속 쟁반에 단계의 2.1.6 마우스를 놓고 수술 도구를 사용 하 여 ensiform 연골을 통해 피부에 작은 절 개를 하 게 합니다.
- 흉부와 복 부 지역 노출 양손으로 절 개를 확장 합니다.
- 노출 횡 경 막, 복 막 열고 양쪽에 다이어 프 램을 엽니다.
- 흉부 새 장 양쪽 모두 앞쪽 axillary 라인을 따라 잘라 다음 마음을 노출 thymus의 위치에서 가로 방향으로 절단 하 여 흉 벽을 제거 합니다.
- 혈액을 배수 하 고 좌 심 실의 꼭대기에 22 게이지 날개 달린된 바늘을 삽입 하는 오른쪽 아 트리 움의 auricle에 작은 절 개를 확인 합니다. Perfuse 버퍼 10% 중성 포 르 말린 솔루션으로 조직에 플런저를 밀어.
- 골반에 장기 노출 후, 항문에서 직장의 끝을 잘라 하 고는 mesentery를 절단 하 여 시체에서 내장을 분리 합니다.
- 공장을, 4cm 위 동굴의 항문 쪽에서에서 내장을 잘라. 나머지 소장의 항문 절반을 삭제 합니다.
- 반 물 내리는 절차를 촉진 하기 위하여 공장을 클립. 부하 20 mL의 10% 중성 포 르 말린 용액 20 mL 주사기에 버퍼링 고 18 게이지 바로 바늘 단계 1.7 콘센트에서에서 준비를 연결 합니다.
- 잘린된 공장 장의 내용을 제거 하 고 창 자 루멘 표면 (그림 1A2)를 해결 하기 위해의 한쪽 끝에서 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 솔루션을 주입.
- 2.1.15 단계에서 설명한 대로 PBS를 주입 하 여 창 자 루멘을 씻어.
- 2.1.15 액체 젤라틴 PBS 바꿉니다 단계에서 설명한 대로 창 자 루멘에 액체 젤라틴을 플러시.
- 6-0 나일론을 사용 하 여 봉합 결 찰에 의해 잘린된 공장의 가까이 한쪽 잘라 봉합 하 고 액체 젤라틴 공장 채울 봉합 결 찰 (그림 1A3)에 의해 반대쪽 끝을 닫습니다.
- Cryomold (그림 1A4)의 우울된 부분에 소시지 모양의 공장 섹션에 맞게 4 봉합 사 매듭을 추가 합니다.
참고: cryomolds는 20 m m x 25 m m x 5 m m 우울된 섹션으로,에 대 한 ~ 20 밀리미터 소시지 같은 공장 섹션이 바람직합니다. - 4 ° c.에서 하룻밤 버퍼링 10% 중성 포 르 말린 용액에 15% 자당의 50 mL에 조직을 담근 다
참고: 이러한 단계 젤라틴 및 조직의 포 르 말린에 의해 자당 및 단백질 고정 하 여 cryoprotection을 확인합니다. 실시간에 고정 되지 않은 gelatinized 젤라틴 4 ° C에서 녹는 반면 말린 gelatinized 젤라틴 RT에 녹여 하지 않습니다.
3. 젤라틴 가득 공장 조직의 스냅
- 봉합 사 매듭에 공장을 잘라서 출혈 양쪽으로 3 개의 소시지 같은 공장 조각 (그림 1A4) 얻을 수 있습니다. 소시지와 같은 조각 포함 동결된 조직 표본의 준비에 대 한 화합물의 추가 대 한 cryomold에 맞춥니다.
- 스냅 동결에 액체 질소로 냉각 isopentane cryomold. Cryomolds-80 ° C에서 저장
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
4. 면역 형광이 술의 부동성 Cryosections를 사용 하 여 세포
- Cryosectioning
- -22 ° c cryostat 챔버 온도 (CT) 및 개체 온도 (OT)를 설정 장소 냉동된 조직 적어도 15 분 동안 cryostat 챔버에 cryomold에서 차단 합니다.
- 35 m m 문화 접시에 PBS의 3 mL를 추가 합니다.
- cryomold에서 냉동된 조직 블록을 제거 하 고 공장의 횡 근 섹션 노출 면도날으로 반 블록을 잘라. 탑재 한 척 (cryostat 어댑터) 절단 평면 면도날을 섹션에 블록의 절반.
- 섹션 30 µ m 두께 섹션으로 젤라틴 가득 공장. 사용 고정 집게를 부드럽게 준비 단계 4.1.2 (그림 2B오른쪽)에서 35 m m 문화 접시에 섹션을 전송 합니다.
- 1 차 항 체의 응용
- 각 상호 통에 가벼운 떨고와 3 mL PBS-T와 함께 5 분에 대 한 3 회 35 m m 문화 접시에 부동성 섹션을 세척 (약 36 회 / 분).
- Antigen 검색 솔루션 준비: 초순 2.7 mL에 항 원 검색 솔루션 집중 (자료 테이블)의 0.3 mL. 부동성 섹션을 포함 하는 35 m m 문화 접시에 항 원 검색 솔루션의 3 mL를 추가 합니다.
- 뚜껑을 닫고, 접시와 뚜껑 비닐 테이프의 스트립 사이의 간격을 밀봉 하 고 동요 하지 않고 3 h에 대 한 교 잡 인큐베이터에서 50 ° C에서 품 어.
- 인큐베이터를 20 분에 대 한 RT에서 멋진 요리를 제거 합니다. 비닐 테이프를 제거 후 씻어 3 시간 5 분 동안 각 3 mL와 함께 PBS-T와 온화한 동요의 섹션.
- PBS-T 발음을 섹션에 차단 솔루션 (자료 테이블)의 5 방울을 추가 합니다. 온화한 동요와 함께 5 분 RT에서 품 어.
- 1 차적인 항 체 솔루션 준비: 인 Y1798 (pY1798) girdin 항 체 (자료 테이블)의 5 µ L와 PBS에서 5 %BSA 495 µ L. 1 차적인 항 체 (차단 솔루션이 필요 하지 않습니다 제거) 섹션에 솔루션의 500 µ L를 추가 합니다.
- 부 화 습도 챔버에 접시를 놓고 가벼운 떨고와 4 ° C에서 밤새 품 어.
참고: 하룻밤 외피는 최대 3 박에 확장할 수 있다.
- 이차 항 체의 응용
- 워시 3 번 5 분 동안 각 3 ml에서 PBS-T 가벼운 진동의 섹션.
- 희석된 DAPI 재고 솔루션을 준비: DAPI 재고 솔루션 (단계 1.5), PBS의 998 µ L의 2 µ L.
- 이차 항 체 솔루션: PBS, 희석된 DAPI 솔루션, phalloidin-형광 염료 어원이 재고 솔루션의 12.5 µ L, 염소-토끼 IgG-형광 염료 켤레의 1 µ L의 10.5 µ L에에서 5 %BSA 476 µ L (파장: 여기 496 nm, 방출 520 nm).
- PBS-T 발음, 후 이차 항 체 솔루션을 적용 하 고 온화한 떨고와 30 분 RT에서 빛 차폐 인큐베이션 챔버에 품 어.
- 3 시간 5 분 동안 각 3 mL와 함께 PBS-T와 온화한 동요의 섹션을 씻어.
- 최종 세척 후 PBS-T를 제거 하 고 polyoxyethylene(10) octylphenyl 에테르 부족 PBS의 3 mL을 바꿉니다. 입체 음향 현미경에 접시를 전송.
- 장소 200 µ L의 PBS P200 피펫으로 팁을 사용 하 여 작은 물방울에 접시에서 매스 코팅 흰색 유리 슬라이드와 이전 한 공장 섹션의 중앙에 작은 물방울에서.
- 입체 현미경 섹션 맞춤 조정 후 섹션을 둘러싼 모든 나머지 PBS 발음.
- 수성 설치 미디어의 20 µ L을 추가 하 고 미디어 꼭대기 20 x 20 m m coverslip 장소.
- 즉시 크 실 렌 기반 설치 미디어와 함께 coverslip 가장자리 물개. 나무 mappe에 슬라이드를 놓고 2-3 h에 대 한 RT를 공고히 자일 렌 기반 설치 미디어를 허용 합니다.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 자일 렌 기반 설치 미디어 굳은 후 슬라이드 실시간에 빛 차폐 슬라이드 상자에 2-3 주 동안 저장 될 수 있습니다.
5. confocal 현미경 검사 법
- 공초점 현미경의 63 X 목표에 집중 기름을 넣어. Coverslip 슬라이드를 거절 하 고 무대에 슬라이드를 놓습니다.
- 레이저 파장 405, 488, 555 nm, 인수 TC 이미지를 디지털화 하 고 tiff 형식 (.tiff) 이미지를 저장 합니다.
참고: 형광 염료에 대 한 적절 한 검색 필터 세트를 선택 (즉, 여기/방출 맥시 마: 358/461 nm, 490/525, 및 590/617).
Representative Results
젤라틴-공장의 작성
젤라틴-충전 (그림 1B)의 혜택은 젤라틴으로 마우스 공장을 작성을 위한 일반적인 절차 (그림 1A), 표시 됩니다. 간단히, 18 게이지 바로 바늘의 경사진된 팁 피어 싱 창 자 벽 (그림 1A1) 로부터 보호 하기 위해 제거 되었습니다. 젤라틴 채우기 사용 하 여 달성 했다 10% 액체 젤라틴 ( 작성 전에 중립 말린 솔루션 잘린된 공장 섹션 소장 하 고 창 자 루멘 표면 (그림 1A2)를 해결 하기 위해의 한쪽 끝에서 주입을 버퍼링 그림 1A3). 결과 소시지 모양의 조각 (그림 1A4) 내장, 냉동, 되었고 transversely는 cryostat에서 30 µ m 두께 조각으로 구분. 작성 하는 젤라틴의 부재, 꼬임, 뒤로 스윙 villi 허용 (그림 1B왼쪽) jejunal 섹션에 의하여 경향이 있다. 젤라틴 작성 섹션의 둥근 디스크 모양을 유지 하 고 (그림 1B오른쪽) villi의 수직 위치를 유지. 이미지는 명확 하 게 작성 부동성 공장 섹션의 형태를 보존 하는 젤라틴에서 제공 하는 혜택을 나타냅니다.
장 술 셀의 성공적인 영상
pY1798 항 체 점 럽, 부 럽, 파라핀 섹션 얼룩, 얼룩, 해 동 실장 cryosection 또는 부동성 cryosection1,9얼룩을 포함 하 여 변수 immunostaining 기술을 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 형광 pY1798 항 체, phalloidin, TCs1의 구조적 특성을 설명 하기 위해 얼룩 DAPI를 사용 하 여 마우스 공장에서 TCs의 얼룩에 대 한 자유 롭 뜨 cryosections에 집중 했다. 일반적으로, TCs는 약 한 TC/100 상피 세포 모 팁에서 토 굴1의 속도로 흩어져 있습니다. 대표 결과 그 pY1798 reproducibly 막, 스풀 모양 소마와 강하게 스테인드 lumenal 팁, 강력한 신호 응축 튀어나온 TC1의 ' 술'에 해당 하는 곳의 세포질을 포함 하 여 전체 TCs를 구분 (그림 2A-2B). 한편, phalloidin phallotoxin, 버섯 버섯 phalloides에서 유독한 bicyclic heptapeptides의 가족 이며 장 브러시 테두리를 이루는 microvilli에 filamentous 말라 (F-말라)에 대 한 높은 선호도가지고 11. Phalloidin reproducibly와 눈에 띄게 표시 rootlets 술1에서 확장의 질량에 해당 하는 굵은 브러시 테두리. 따라서, pY1798 신호 (스풀 모양 소마, lumenal 끝 신호 응축) 눈에 띄게 두꺼워 phalloidin 양성 브러시 테두리의 일관 된 공동 지역화 방법을 보여 줍니다이 프로토콜 성공적으로 관계 없이 TCs 식별 여부 그들은 토 굴그림 2B) (또는 모그림 2A) (에.
낮은-온도 항 원 복구 부동성 섹션 얼룩에 효과적입니다.
95-99 ° C에서 열 기반 항 원 복구 파라핀 섹션 및 슬라이드 마운트 cryosections의 분석을 위해 널리 이용 된다. 그러나 이러한 섹션은 일반적으로 슬라이드12에서 지원 되는 슬라이드 마운트 섹션 보다 더 깨지기 때문에, 손상을 초래 하지 않고 부동성 섹션에 적용이 접근 어려운입니다. 저온 항 원 복구 (50 ° C 3 h)부터 물 목욕을 사용 하 여 미치지 않았다 형태 우리 장 님에서 항 원 복구의 객관적인 효과 평가 하는 예비 실험에서 부동성 공장 섹션의 테스트를 통계적으로 낮은 온도 항 원 복구 (그림 3)의 효과를 확인 했다.
그림 1: cryosections의 형태 보존을 위한 공장 부분의 젤라틴 작성
젤라틴으로 마우스 공장 intraluminal 작성 절차의 (A) 사진. (A1) 18 게이지 바로 바늘의 경사진된 팁을 용기 벽을 관통 하는 피하기 위해 제거 되었습니다. (A2) 버퍼링 된 중성 포 르 말린 용액 (10%)는 잘린된 공장 장의 내용을 플러시하고 창 자 루멘 표면 수정에 한 쪽 끝에 주입 했다. (A3) 잘린된 공장 액체 젤라틴 및 출혈 6-0 나일론 봉합 (검은 화살표)를사용 하 여 양쪽으로 가득 합니다. (A4) 4 더 많은 봉합 사 매듭 (흰색 화살표) 기존 봉합 매듭 (검은 화살표) 사이 3 개의 짧은 조각 나왔고. 조직은 다음 두 개의 지정 된 위치 (흰색 화살표)에서 3 개의 소시지 모양의 조각으로 구분 됩니다. (B) 부동성 cryosection 형태학에 젤라틴 채우기의 유익한 효과 젤라틴 작성 없이 섹션 경향이 꼬임, 쉽게 뒤로 (왼쪽); 스윙 villi 허용 젤라틴 작성, 30 µ m 두께 섹션 디스크 모양 유지와 villi의 수직 위치는 보존 (오른쪽). 이미지는 Nomarski 미분 간섭 명암을 사용 하 여 촬영 했다. 스케일 바, 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표적인 형광 이미지 마우스 장 술 셀의
TCs 모 (A) 또는 토 굴에서의 공초점 형광 이미지 (B), 부동성 마우스 공장 섹션에서 사이트별로 얼룩진 고 인 산화 상태 특정 항 체에 대 한 girdin에 티로신 phosphorylated 1798 ( pY1798, 녹색, 최적의 여기/방출 파장 490/525 nm), phalloidin (빨강, 590/617 nm), 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 파랑, 358/461 nm). 낮은 확대 이미지 (스케일 바, 50 µ m)에서 흰색 상자로 둘러싸인 영역 오른쪽 (스케일 바, 10 µ m)에 확장 됩니다. pY1798 항 체 reproducibly 위치 ( (A), 모에 또는 (B)토 굴에서), lumenal 팁 (화살표), 막, 및 스풀 모양 TC 소마의 세포질에 얼룩과 TCs, 얼룩. Phalloidin 얼룩 (화살촉)에서 눈에 띄게 굵은 브러시 테두리는 TCs의 또 다른 독특한 기호 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 낮은 온도 항 원 복구 pY1798 면역 형광을 향상 시킵니다.
실험 절차의 두 그룹-저온 항 검색의 효율성을 확인 비교 되었다. 부동성 공장 섹션 (30 µ m 두께, n = 13)에서 단일 고정된 블록 두 그룹으로 분할 되었다 및 각 그룹에서 섹션 전체 프로토콜 다음 얼룩진 했다 또는 같은 프로토콜 부족 저온 항 원 복구 (4.2.2 단계). 얼룩, 후 섹션 그룹 숫자, 표시 하는 개별 슬라이드에 장착 했다 고 마스킹 테이프로 덮여 있었다 각 슬라이드에 라벨. 모든 슬라이드 단행, 테이프에 새로운 숫자 표시 되었고 FITC 필터를 통해 형광 현미경에서 관찰. 표시 pY1798 양성 TCs의 총 수는 각 그룹에 평균 했다 하 고 막대 그래프 (평균 ± 표준 편차)에 표시 했다. 두 꼬리 t-검정은 두 그룹 사이의 평균 수를 비교 위해 수행 되었습니다. P-값이 0.05 이하로 통계적으로 간주 됐다. 저온 항 원 복구는 크게 pY1798-면역 형광의 효율성을 개선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 술 셀 (TCs)의 신뢰할 수 있는 이미지를 얻기 위해 조직학 경험 없이 연구를 허용 하도록 설계 되었습니다. 이 프로토콜은 3 개의 중요 한 포인트: 1) 사이트 및 인 산화 상태 특정 토끼 polyclonal 항 체의 티로신 1798 (pY1798 항 체)에 phosphorylated 인간 girdin에 대 한 특정 회사 (에서 가져온 된 사용 Immuno-Biological 실험실 회사 X =); 2) 젤라틴 작성 공장; 그리고 3) 저온 항 원 복구. 넓은 의미에서 인 산화 상태 특정 항 체의 포스트 번역 상 수정 (예: acetylation 이나 메 틸 화, 인 산화)의 특정 유형을 인식 수정-특정 항 체로 분류 될 수 있다는 특정 한 아미노산 잔류물에 단백질입니다. 오모리 외. 회사 X는 공동 phosphorylated 펩 티 드와 토끼를 면역 하 고 다음 이동의 방법9, unphosphorylated 펩타이드와 고체 상 크로마토그래피를 사용 하 여 결과 항 체를 순화 하 여 pY1798 항 체를 생성 10. pY1798 항 체/티로신 17989점 돌연변이 없이 전체 길이 인간의 girdin 식 벡터를 사용 하 여 인 산화 분석 생체 외에서 집중적으로 검증 했다. 그 후, Kuga 연구진이 발견 회사 X에서에서 pY1798 항 체 장 TCs1의 구체적이 고 민감한 마커. 따라서, 회사 X에서에서 pY1798 항 체의 포함이이 프로토콜에서 중요 한 포인트 이다.
젤라틴 동물의 조직에서 추출한 콜라겐을 포함 하 고 오래 조직화 학적인 연구 cryosections13를 사용 하 여 조직 표본을 포함 하는 데 사용 되었습니다. 4 ° C에서 gelatinized 하지만 상 온에서 녹는 다, 낮은 녹는 포인트 젤라틴14를 포함 하는 동안 액체 상태에 젤라틴을 유지 하는 데 필요한 열의 부작용을 피하기 위해 적용 하기 시작 했다. 이 프로토콜에서 낮은 녹는 포인트 젤라틴 4 ° C에서 gelatinizes RT에서 녹는 젤라틴 파우더에서 만든 마우스 공장의 가로 cryosections의 형태를 유지 하기 위해 사용 되었다. 이 젤라틴을 완전히 공장을 채우기 위해 사용 되었다 때 샘플 다음 포 르 말린-고정 했다 돌이킬 수 없는 젤라틴을 달성 하기 위해. 열 유도 항 원 복구 알데하이드를 포함 하는 fixatives12의 복 면 된 항 원 노출 하는 효과적인 방법입니다. 그러나, 고온 (30 분 동안 95-99 ° C) 일반적으로 파라핀 섹션의 분석에 사용 되는 복잡 한 조직/젤라틴의 형태를 손상 수 있습니다. 여기 우리는 항 원 검색 및 조직의 형태학의 보존을 허용 하는 낮은 온도 항 원 복구 (50 ° C 3 h)를 사용 합니다.
pY1798 항 체는 마우스 공장 뿐만 아니라 생쥐와 인간1에서 여러 기관 (위, 회장, 콜론, 및 쓸 개)에서 TCs 레이블을 수 있습니다. 그러나, 어떤 조직에서 떼어낸된 조직에서 pY1798 신호 저하 빠르게 됩니다 때문에이 프로토콜 포함 공장 루멘에 말린 주입 (단계 2.1.15., 그림 1A2).
부동성 cryosections의 두께와 관련 된 제한이 있습니다. 얇은 cryosections 현미경 검사 법에 대 한 반투명 측면에서 유리한 될 수, 있지만 두께 게이 섹션 육체적으로 취약. 대조적으로, 두꺼운 cryosections 육체적으로 튼튼한, 하지만 낮은 항 체 침투성 섹션으로. 이 프로토콜에서 30 µ m 두께 섹션 사용 되었다 육체적 안정 및 항 체에 융 화 했다. 프로토콜 실패 해야 하는 경우이 방법은 조직학, 광범위 한 경험 없이 연구자에 대 한 설계 되었습니다, 비록 구가 외 에서 사용 하는 유사한 섹션 pY1798/villin/DAPI 트리플 파라핀의 얼룩 1수행된 될 수 있습니다. 파라핀 섹션 했다 phalloidin F-말라 파라핀 섹션에서의 얼룩과 관련 된 어려움을 피하기 위해 여기 사용 되지 않습니다.
티로신-1798 girdin에 인접 한 아미노산 시퀀스의 보존 때문에 pY1798 항 체 마우스, 쥐, 인간을 포함 한 다른 종에서 TCs를 얼룩에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 되는 젤라틴 작성 또한 다른 빈 기관에 대 한 적용할 수 있습니다. 실제로, pY1798, TC, 저온 항 원 복구와 함께 작성 하는 젤라틴의 조합 그리고 악명에 마우스, "어려운" epitopes를 공개 하는 데 유용 수 있습니다 결과적으로, 많은 연구자에 대 한 관심이 있을 수 있습니다.
Girdin의 생물학 역할 및 TCs에 그것의 인 산화의 의미는 명확 하지 않습니다. 그러나, 린 외에 의해 연구 제안 그 티로신 인 산화 girdin의 F-말라 합8의 학위와 관련. 한편, Kuga 연구진이 발견 그 치명적인 apoptosis inducers의 복용량 (예., cisplatin, x 선 방사선) 연결 될 수 있습니다 그들은 가상 마우스 소장에서 TCs의 상대 주파수에서 큰 증가 발생는 가능 enterocytes에서에 변환 TCs, microvilli1girdin의 인 산화와 동기화. 이 가능성은 미래에 추가 조사가 필요 합니다. 최근 급속 한 관찰 3 그룹 기생충 감염15,,1617다음 TC 주파수에서 증가. 따라서,이 부동성 얼룩 뿐만 아니라 인간의 용기 라고 수집 조직, 분석에 사용 될 수 있지만 TC 축적 수 또한 인간의 창 자에서 기생충 감염의 진단에 도움이 됩니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
나고야 대학에서 요코타 나 오 유야 아 사이 부동성 공장 섹션에 대 한 낮은 온도 항 검색의 개발에 대 한 유용한 제안을 제공 하는 감사 합니다. 이 작품 지원 연구비에 의해 Scientific Research (KAKENHI) (C) 2012 (JP25460493)와 (B) 일본 사회 과학의 승진 (JSP)에 대 한 2017 년 (JP17H04065), A 단계 부여 2014 (AS251Z02522Q) 및 2015 년 (AS262Z00715Q)에서 일본 과학 기술 기구 (JST)와 다케다 비전 연구 (석사)에 다케다 과학 재단에서 부여 2014.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slc:DDY 6-week-old female mice | Chubu Kagaku Shizai | Not applicable | |
| Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) | Wako | 196-02835 | |
| Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O | Wako | 199-02825 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Wako | 199-10665 | |
| Triton X-100, Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether | Katayama Chemical | Not applicable | |
| Sucrose | Wako | 190-00013 | |
| 10% buffered neutral formalin solution | Muto Chemical | 20215 | Step 1.3. |
| Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12381 | |
| Methanol | Nacalai Tesque | 21915-35 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| N.N-dimethylformamide (DMF) | Nacalai Tesque | 13015-75 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-10G | |
| 18-gauge stainless steel straight needle | Terumo | NN-1838R | |
| U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun | Kono Seisakusho | Not applicable | |
| 22-gauge winged needle | Terumo | SV-22DLK | |
| 20 mL TERUMO syringe | Terumo | SS-20ES | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 15 mL Iwaki centrifuge tubes | Iwaki | 2325-015 | |
| 1.5 mL micro test tube | Star | RSV-MTT1.5 | |
| Gelatin powder, Gelare-blanc | Nitta Biolab | 2809 | |
| Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece | Sakura FineTech | 4583 | |
| Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) | Shoei Work's | 1101-3 | |
| Isopentane | Nacalai Tesque | 26404-75 | |
| Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip | Corning | 353001 | |
| Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x | Dako | S2367 | Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2. |
| Protein Block | Dako | X0909 | Blocking solution in 4.2.5. |
| Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies | Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X | 28143 | Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6. |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 | Matsunami Glass | C022221 | |
| Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy | Merck Millipore | 107961 | |
| MAS-coated slide glass white | Matsunami Glass | MI-MAS-01 | |
| Wooden Mappe KO-type | Shoei Work's | 99-40007 | |
| Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml | Zeiss | 444960 | |
| Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) | Gilson | F144801, F123600, F123601, F123602 | |
| Ultrapure water production system | Advantec | GS-590 | |
| Plastic glove, Star Nitrile Glove | Star | RSU-NGVM | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1950 | |
| Deep freezer, SANYO Ultra Low | Sanyo | MDF-382 | |
| Showcase refrigerator | Nihon Freezer | NC-ME50EC | |
| Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) | Taitec | 0068750-000 | |
| Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) | Taitec | HB-100 | |
| Incubation chamber for immunostaining | Cosmo Bio | 10DO | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) | Taitec | NR-1 | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) | Tokyo Rika Kikai | MMS-3010 | |
| Stereoscopic microscope (for tissue handling) | Olympus | SZ61 | |
| Stereoscopic microscope (for Figure 1B) | Leica Microsystems | M165FC | |
| Fluorescence microscope (for Figure 3) | Nikon | E800 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Zeiss | LSM700 |
References
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