Summary
Kuga et al descubrieron que los anticuerpos específicos de fosforilación-estado contra la actina Unión proteína girdin fosforiladas en tirosina 1798 (pY1798) pueden utilizarse para identificar células de penacho (TCs). Este protocolo permite la visualización sólida de TCs con tinción inmunofluorescente de yeyuno flotante cryosections con anticuerpos pY1798.
Abstract
La Unión de actina proteína girdin es una proteína citosólica que se requiere para la actinia remodelación para activar migración celular en varios tejidos. Girdin es fosforilado por receptores y no receptores tirosina quinasas en tirosina 1798. Omori et al desarrollaron sitio y fosforilación estado anticuerpos específicos contra girdin humano en tirosina-1798 (pY1798), que se unen específicamente a tirosina fosforilada-1798, pero no a unphosphorylated tirosina-1798. pY1798 anticuerpos se han utilizado para etiquetar específicamente células de penacho (TCs) que están presentes en los tejidos gastrointestinales mamíferos, pero la función de estas células está clara. Este protocolo permite la visualización sólida de TCs en el yeyuno mediante inmunofluorescencia y anticuerpos pY1798. Para asegurar el éxito y simple visualización de TC, este protocolo incluye dos técnicas histológicas: producción de cryosections libre-flotante del tejido yeyuno lleno de gelatina y recuperación de antígeno de baja temperatura a 50 ° C para 3 h llenado de yeyuno con gelatina mantiene la forma de secciones flotan libremente a través del procedimiento de tinción, mientras que la recuperación de antígeno de baja temperatura asegura señal robusta de TCs. uso acertado de este protocolo los resultados pY1798 la tinción de TCs distribuidos desde la punta de la vellosidad hasta cripta. TCs manchadas tienen un soma en forma de carrete y señales fluorescentes condensan en la punta lumenal, que corresponde al sobresaliente 'penacho'. Phalloidin tinción colocalized con TCs pY1798-positivo en el borde en cepillo espesada y corresponde a una masa de raicillas que se extiende desde el penacho de la TC. Este protocolo se podría utilizar para examinar TCs en las muestras de biopsia humana recogidas con endoscopios gastrointestinales. Además, TCs recientemente se informó que se acumulan después de infección parasitaria en ratones, lo que sugiere que este protocolo podría tener aplicaciones para el diagnóstico de infecciones por el parásito en el intestino humano.
Introduction
Células de penacho (TCs) son componentes menores dispersos de epitelio gastrointestinal que se caracteriza por penachos apicales y Soma en forma de carrete1. Aunque TCs primero fueron descritos en 19562, función del TC sigue siendo confusa, en parte debido a la falta de marcadores de TC confiables.
Enomoto et al. primero caracteriza la proteína de unión a actina girdin3, que se expresa en el sistema nervioso, así como en tejidos no neuronales tales como vasos sanguíneos, válvulas cardíacas, tendones y músculo esquelético4. Ratones con la ablación genética de girdin Mostrar retraso de crecimiento y múltiples cerebrales anomalías4,5,6. Mientras tanto, mutación de la pérdida de función en girdin humano se asocia con encefalopatía progresiva, retraso severo y temprano de las crisis epilépticas de inicio7.
En 2011, Lin et al. identifica dinámica fosforilación de girdin en tirosina 1798 mediada por quinasas de tirosina como EGFR y fuente8. También mostraron que girdin fosforilada se requiere para actina remodelación para activar migración de célula8. Omori et al. desarrollado y fosforilación estado específicos anticuerpos contra humanos girdin fosforiladas en tirosina 1798 (anticuerpos pY1798) siguiendo el protocolo de Goto y validaron los anticuerpos mediante mutagénesis sitio-dirigida de vectores de expresión transporte integral girdin9,10. En 2017, Kuga et al. informó que pY1798 etiquetas TCs con alta especificidad y alta sensibilidad1. Los anticuerpos pY1798 fueron demostrados para ser superior a los anteriores marcadores de TC basados en excelentes propiedades de tinción que revelaron la forma de células completas, incluyendo la característica 'penacho' en la punta del lumenal, todavía la función biológica de las girdin y fosfo-girdin en TC la función seguía siendo confuso1.
El método descrito en este estudio implica la inmunofluorescencia que manchaba, una técnica histológica para marcar una proteína específica de tejido usando un anticuerpo primario contra una proteína de la blanco y un anticuerpo secundario conjugado fluorescencia contra el principal anticuerpos. El propósito de este método es que permiten a los investigadores con poca experiencia histológico obtener imágenes de la TC de alta calidad. Este protocolo utiliza cryosections flotante que evitar la necesidad de cryosections montada diapositiva, o parafina sección. Sin embargo, secciones flotan libremente son frágiles debido a la falta de apoyo de un portaobjetos de vidrio y el espesor de sección puede disminuir permeabilidad del anticuerpo. Este protocolo incluye dos enfoques que superar estos problemas: 1) llenar el lumen yeyuno todo con gelatina para preservar la morfología de las secciones flotan libremente a través de los procedimientos de tinción y 2) el uso de recuperación de antígeno de baja temperatura a intensificar las señales pY1798.
Protocol
Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el cuidado de animales y uso del Instituto para la investigación del desarrollo, centro de servicios humanos de Aichi (número de solicitud: M-03).
1. preparaciones
- Preparar 10 L de tampón fosfato salino (PBS): 32,27 g de Na2HPO4·12H2O, 4,5 g de NaH2PO4·2H2O, 80,0 g de NaCl agregado a agua ultrapura hasta un volumen final de 10 solución de L. almacén a temperatura ambiente (RT).
- Preparar 200 mL de PBS-T: 200 mL de PBS en el paso 1.1 con 100 μl de éter de Octylpheny de polyoxyethylene(10) a una concentración final de 0.05% (vol:vol). Tienda a TA.
- Mientras que usa guantes y protección ocular, preparar 50 mL de sacarosa al 15% en solución de formol neutro al 10% tamponado: 7,5 g de sacarosa añadida al 10% tamponada con solución de formalina neutra (Tabla de materiales) hasta un volumen final de 50 mL. Tienda a TA.
PRECAUCIÓN: La inhalación y la piel, ojo contacto con formaldehído en solución de formol neutro al 10% tamponado puede ser peligroso. Manejar con precaución. - Preparar 1,5 mL de 200 unidades/mL tinte phalloidin-fluorescente conjugada solución: conjugado colorante phalloidin-fluorescente (300 unidades 1 frasco ampolla, liofilizados sólidos, longitudes de onda de excitación y emisión: 581 nm y 609 nm, respectivamente) en 1,5 mL de metanol. Almacene la solución en la oscuridad a-20 ° C.
- Preparar 5 mg / mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole, diclorhidrato (DAPI) bolsa solución: 10 mg de DAPI en 2 mL de N, N-dimetilformamida (DMF). Almacene la solución en la oscuridad a-20 ° C.
- Preparar 5% albúmina sérica bovina (BSA) en PBS: 0,5 g de BSA, 10 mL de PBS. Almacenar a 4 ° C.
- Quite la punta biselada de una aguja recta de calibre 18 con una pinza y pellizcar el extremo quemado con un pincher en una dirección longitudinal para permitir que el líquido fluya a través del lumen de la aguja (figura 1A1).
Nota: El protocolo se puede detener aquí.
2. animal disección y aislamiento del yeyuno
- Fijación de la perfusión de un ratón
- Utilice guantes y trabaje en un área bien ventilado.
- Preparar un vaso de precipitados de vidrio de 100 mL, 10% tamponada con solución de formalina neutra, herramientas quirúrgicas (tijeras, pinzas), una bandeja metálica, nylon 6-0 corta suturas, una aguja de calibre 18 recta preparada como en la 1.7, una aguja con alas de calibre 22, una jeringa de 20 mL.
- Carga 20 mL de solución de formol neutro al 10% tamponado desde el vaso de vidrio en la jeringa de 20 mL y conecte la aguja de calibre 22 con alas a la salida.
- Preparar Gelatina líquida mediante la adición de 1 g de polvo de gelatina en 20 mL de PBS (final 5% de gelatina) en un tubo de centrífuga de 50 mL. Después de empapar a temperatura ambiente por 15 minutos, incubar a 50 ° C en un baño de agua durante 15 minutos sin agitación.
- Brevemente vortex e incubar a 50 ° C para otros 15 minutos disolver completamente la gelatina. Dejar el tubo a temperatura ambiente hasta su uso.
- Eutanasia a un ratón adulto por dislocación cervical.
- Coloque el ratón de paso 2.1.6 en una bandeja metálica y haga una pequeña incisión en la piel a través del cartílago ensiforme utilizando herramientas quirúrgicas.
- Ampliar la incisión con ambas manos al exponer las regiones torácicas y abdominales.
- Abrir el peritoneo para exponer el diafragma y abra el diafragma en ambos lados.
- Corte la caja torácica en la línea axilar anterior en ambos lados, luego retire la pared torácica por corte en una dirección transversal a la posición del timo para exponer el corazón.
- Realice una pequeña incisión en la aurícula del atrio derecho para drenar la sangre e insertar una aguja de calibre 22 con alas en el ápice del ventrículo izquierdo. Empuje el émbolo para la perfusión de los tejidos con solución de formol neutro al 10% tamponado.
- Después de exponer los órganos en la pelvis, cortar el extremo del recto por el ano y separar los intestinos del cuerpo cortando el mesenterio.
- Para aislar el yeyuno, corte los intestinos a 4 cm de la parte anal del antrum gástrico. Deseche la mitad anal del intestino restante.
- Clip el yeyuno por la mitad para facilitar el proceso de lavado. Carga 20 mL de 10% tamponada con solución de formalina neutra en la jeringa de 20 mL y coloque la aguja recta calibre 18 en paso 1.7 a la salida.
- Inyectar solución formalina neutra al 10% tamponado desde un extremo del yeyuno recortado para eliminar el contenido intestinal y para fijar la superficie del lumen intestinal (figura 1A2).
- Lave el lumen de la tripa mediante la inyección de PBS como se describe en el paso 2.1.15.
- Al ras Gelatina líquida en el lumen del intestino como se describe en el paso 2.1.15 reemplazar PBS con gelatina líquida.
- Cierre un extremo del yeyuno recortado por la ligadura de la sutura con un nylon 6-0 cortar sutura, llene el yeyuno con gelatina líquida y cerrar el extremo opuesto por la ligadura de la sutura (figura 1A3).
- Añadir cuatro nudos de sutura para una sección del yeyuno en forma de salchicha a la parte deprimida de un cryomold (figura 1A4).
Nota: Para cryomolds de 20 mm x 25 mm x 5 mm deprimido sección, una sección del yeyuno parecida a salchicha de ~ 20 mm es preferible. - Remoje los tejidos en 50 mL de sacarosa al 15% en solución de formol neutro al 10% tamponado durante la noche a 4 ° C.
Nota: Estos pasos aseguran de crioprotección por fijación de sacarosa y proteínas por formalina de tejido y gelatina. Gelatina gelatinizada con formol no se funde a temperatura ambiente, mientras que gelatina gelatinizada no fija a 4 ° C se funde a TA.
3. enganche la congelación de los tejidos llena de gelatina yeyuno
- Cortando el yeyuno en los nudos de sutura, tres pedazos de salchicha-como yeyuno con ambos extremos ligadas se obtienen (figura 1A4). Alinee las piezas de salchicha-como en un cryomold para la adición de incrustar para preparación de muestras de tejido congelado.
- Snap freeze cryomold en isopentano enfriado con nitrógeno líquido. Tienda cryomolds a-80 ° C
Nota: El protocolo se puede detener aquí.
4. inmunofluorescencia de penacho de células con Cryosections flotante
- Cryosectioning
- Ajustar la temperatura de la cámara del criostato (CT) y la temperatura del objeto (OT) a-22 ° C. Lugar el tejido congelado bloque en un cryomold en la cámara de criostato para por lo menos 15 minutos.
- Añadir 3 mL de PBS a una placa de cultivo de 35 mm.
- Retire el bloque de tejido congelado de la cryomold y cortar la manzana por la mitad con una cuchilla de afeitar para exponer la sección transversal del yeyuno. Montar una mitad de la manzana en un plato (un adaptador de criostato) a la sección del plano de corte con la hoja de afeitar.
- Sección del yeyuno lleno de gelatina en 30 secciones μm de espesor. Uso congelados pinzas transferir suavemente las secciones en la placa de cultivo de 35 mm preparada en el paso 4.1.2 (figura 2Bderecha).
- Aplicación de anticuerpos primarios
- Lávese las secciones flotan libremente en el plato de cultivo de 35 mm durante 5 minutos cada uno con 3 mL de PBS-T con suave agitación en un agitador recíproco 3 veces (aproximadamente 36 veces / min).
- Preparar solución de recuperación de antígeno: 0.3 mL de concentrado de solución de recuperación antígeno (Tabla de materiales) en 2,7 mL de agua ultrapura. Añadir 3 mL de solución de recuperación de antígeno a la placa de cultivo de 35 mm que contiene secciones flotan libremente.
- Cierre la tapa y sellar el hueco entre el plato y la tapa con una tira de cinta de vinilo, incubar a 50 ° C en una incubadora de hibridación de 3 h sin agitar.
- Retire el plato de la incubadora y enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de quitar la cinta de vinilo, lavar las secciones 3 veces de 5 min con 3 mL de PBS-T y temblor leve.
- Aspire el PBS-T y agrega 5 gotas de solución de bloqueo (Tabla de materiales) en las secciones. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación suave.
- Preparar la solución de anticuerpo primario: 495 μl de 5% de BSA en PBS con 5 μl de fosfo-Y1798 girdin (pY1798) anticuerpos (Tabla de materiales). Añadir 500 μl de solución de anticuerpo primario en las secciones (la solución de bloqueo no necesita ser quitado).
- Coloque el plato en una cámara de incubación humidificado e incubar durante una noche a 4 ° C con agitación suave.
Nota: La incubación durante la noche puede ampliarse a un máximo de tres noches.
- Aplicación de anticuerpos secundarios
- Lávese las secciones 3 veces de 5 min en 3 mL de PBS-T con agitación suave.
- Prepare solución diluida DAPI: 2 μl de la solución madre de DAPI (paso 1.5), 998 μl de PBS.
- Solución de anticuerpo secundario: 476 μl de BSA de 5% en PBS, 10.5 μl de solución diluida de DAPI, 12,5 μl de solución conjugada phalloidin-fluorescente tinte, 1 μl de conjugado colorante de cabra anti-conejo IgG-fluorescente (longitud de onda: excitación 496 nm, emisión 520 nm).
- Después de aspirar el PBS-T, aplique la solución de anticuerpo secundario e incubar en una cámara de incubación protegidos de la luz a temperatura ambiente por 30 min con suave agitación.
- Lávese las secciones 3 veces de 5 min con 3 mL de PBS-T y temblor leve.
- Después del último lavado, eliminar el PBS-T y reemplazar con 3 mL de PBS falta polyoxyethylene(10) Octylpheny éter. Transferir el plato a un microscopio estereoscópico.
- Lugar 200 μL de PBS en una gotita en el centro de un vidrio blanco cubierto MAS diapositivas y transferencia yeyuno una sección del plato a la gota usando una punta de pipeta P200.
- Después de ajustar la alineación de la sección al microscopio estereoscópico, aspirar todo PBS restantes alrededor de la sección.
- Añadir 20 μl del medio de montaje acuoso y coloque un cubreobjetos de 20 x 20 mm en la cima de los medios de comunicación.
- Inmediatamente sellar los bordes del cubreobjetos con medios de montaje con xileno. Colocar el portaobjetos en un mapas de madera y deje que los medios de montaje con xileno solidificar a temperatura ambiente durante 2-3 h.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Después de que los medios de montaje basado en xileno se solidifica, las diapositivas se pueden almacenar durante 2-3 semanas en una caja de diapositivas protegidos luz a TA.
5. confocal microscopio
- Poner el aceite de inmersión en el objetivo 63 de X de un microscopio confocal. Baje el cubreobjetos-portaobjetos y coloque el portaobjetos sobre la platina.
- Digitalizar las imágenes de TC en láser longitud de onda 405 488 y 555 nm y guardar las imágenes en formato tiff (.tiff).
Nota: Elegir un sistema de filtro de detección que es apropiado para los tintes fluorescencia (es decir, los máximos de excitación/emisión: 358/461 nm, 490/525 y 590/617).
Representative Results
Relleno de gelatina del yeyuno
Un procedimiento típico para el llenado de yeyuno ratón con gelatina se muestra (figura 1A), como son los beneficios de la gelatina-llenado (figura 1B). En Resumen, la punta biselada de una aguja de calibre 18 recta fue quitada para proteger contra la perforación de la pared intestinal (figura 1A1). Relleno de gelatina fue alcanzada usando 10% tamponada con solución de formalina neutra inyectado desde un extremo de una sección del yeyuno recortadas para vaciar el intestino y la superficie del lumen intestinal (figura 1A2) antes del llenado con gelatina líquida ( ) Figura 1A3). Los pedazos de salchicha-como resultantes (figura 1A4) fueron encajados, congelados y seccionados transversalmente en rodajas de espesor μm 30 en un criostato. En la ausencia de gelatina relleno, secciones de yeyuno tienden a kink, permitiendo que las vellosidades hacer pivotar hacia atrás (figura 1Bizquierda). Relleno de gelatina conserva la forma de disco redondeada de las secciones y mantiene el posicionamiento vertical de las vellosidades (figura 1Bderecha). Las imágenes indican claramente el beneficio de gelatina relleno en la preservación de la morfología de las secciones de yeyuno libre-flotación.
Exitosa proyección de imagen de las células intestinales del penacho
anticuerpos pY1798 pueden aplicarse técnicas de inmunotinción variable, incluyendo dot Blot, western blot, parafina sección coloración, criosección montado en deshielo tinción o flotante criosección tinción1,9. En este protocolo, nos enfocamos en cryosections flotante para la tinción de fluorescencia de TCs en yeyuno ratón utilizando anticuerpos pY1798, phalloidin y DAPI de tinción para demostrar las características estructurales de ect1. En general, TCs están dispersos en una tasa de aproximadamente un TC/100 células epiteliales desde la punta de la vellosidad cripta1. Los resultados representativos muestran que pY1798 reproducible delinea todos TCs, incluyendo la membrana, el citoplasma del soma en forma de carrete y la punta lumenal fuertemente teñida, donde condensación sólida señal corresponde a los que sobresalen 'penacho' de un TC1 ()Figura 2A-2B). Mientras tanto, phalloidin es un phallotoxin, una familia de la venenosa heptapeptides bicíclica de la seta Amanita phalloidesy tiene alta afinidad para la actinia filamentosa (F-actina), que está presente en las microvellosidades que forman el borde en cepillo intestinal 11. Phalloidin reproducible y prominente marca el borde en cepillo engrosamiento que corresponde a una masa de raicillas que se extiende desde el penacho1. Así, la co-localización coherente de señales pY1798 (soma en forma de carrete, condensación de la señal en la punta del lumenal) con el borde en cepillo prominente engrosamiento de phalloidin-positivo demuestra que este protocolo identifica con éxito TCs independientemente de Si ellos están ubicados en una vellosidad ()figura 2A) o en una cripta ()figura 2B).
Recuperación de antígeno de baja temperatura es eficaz para la tinción de secciones flotan libremente
Recuperación de antígeno basada en calor en el 95-99 ° C es ampliamente utilizado para el análisis de secciones de la parafina y cryosections montados en portaobjetos. Sin embargo, aplicando este enfoque a las secciones flotan libremente sin causar daños es difícil porque tales secciones son generalmente más frágiles que las secciones montada diapositiva que son compatibles con la diapositiva12. Desde recuperación de antígeno de baja temperatura (50 ° C para 3 h) utilizando un baño de agua no afectan la morfología de las secciones de yeyuno libre-flotación en experimentos preliminares, se evaluó la eficacia objetiva de recuperación de antígeno en una ciega de la prueba, que confirmado estadísticamente la efectividad de la recuperación de antígeno de baja temperatura ()figura 3).
Figura 1: Relleno de gelatina de las secciones de yeyuno para la preservación morfológica de cryosections
(A) fotografías de los procedimientos de llenado intraluminal del yeyuno ratón con gelatina. (A1) La punta biselada de una aguja de calibre 18 recta fue retirada para evitar la perforación de la pared intestinal. (A2) Solución de formalina neutra tamponada (10%) fue inyectado en un extremo del yeyuno recortado para vaciar el contenido intestinal y para fijar la superficie del lumen intestinal. (A3) Yeyuno recortada llena con gelatina líquida y los dos extremos de ligarse con un 6-0 nylon sutura (flechas negras). (A4) Cuatro más sutura nudos (flechas blancas) entre las ya existentes de nudos de sutura (flechas negras) rindió tres piezas más cortas. El tejido entonces se separará en tres pedazos de salchicha-como en las dos posiciones indicadas (flecha blanca). (B) efectos beneficiosos del relleno de gelatina sobre la morfología de criosección flotante. Sin relleno de gelatina, las secciones tienden a enroscarse, permitiendo que las vellosidades para fácilmente hacer pivotar hacia atrás (izquierda); con relleno de gelatina, una sección de μm de espesor 30 mantiene una forma de disco y la posición vertical de las vellosidades es preservada (derecha). Imágenes fueron fotografiadas con contraste de interferencia diferencial de Nomarski. Escala de barras, 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de fluorescencia representante intestinal penacho de células de ratón
Imágenes de fluorescencia confocal de TCs en una vellosidad (A) o en una cripta (B), en las secciones de yeyuno ratón flotante teñida con site-specific y fosforilación-estado-específico anticuerpos contra girdin fosforilado en tirosina (1798 pY1798, verde, óptimo de excitación/emisión longitudes de onda 490/525 nm), phalloidin (rojo, 590/617 nm), 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, azul, 358/461 nm). La zona delimitada por cajas blancas en las imágenes de baja magnificación (barras de escala 50 μm) se expande a la derecha (barras de escala, 10 μm). anticuerpos pY1798 reproducible manchan TCs, independientemente de la ubicación (en una vellosidad (A), o en una cripta (B)), con la coloración presente en la punta del lumenal (flechas), membrana y citoplasma del soma de TC en forma de carrete. Un borde en cepillo prominente engrosamiento en phalloidin tinción (flecha) es otro signo distintivo de TCs. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Recuperación de antígeno de baja temperatura mejora la inmunofluorescencia pY1798
Se compararon dos grupos de procedimientos experimentales para confirmar la efectividad de la recuperación de antígeno de baja temperatura. Secciones de yeyuno libre-flotación (30 μm de espesor, n = 13) de un solo bloque congelado se dividieron en dos grupos y las secciones de cada grupo se tiñeron siguiendo el protocolo completo o el mismo protocolo de recuperación que carecen de antígeno de baja temperatura (paso 4.2.2). Después de la tinción, las secciones fueron montadas en diapositivas individuales etiquetados con los números de grupo, y el etiquetado en cada diapositiva fue cubierto con cinta adhesiva. Todas las diapositivas se barajan etiquetadas con nuevos números en la cinta y observadas bajo microscopía de fluorescencia a través de un filtro FITC. Total cuentas de TCs pY1798-positivos visibles fueron hechas un promedio en cada grupo y se muestran en un gráfico de barras (media ± desviación estándar). Se realizó una prueba de t dos colas para comparar las cuentas promedio entre los dos grupos. Valores de P por debajo de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Recuperación de antígeno de baja temperatura mejoró significativamente la efectividad de la pY1798-inmunofluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo fue diseñado para permitir a los investigadores sin experiencia de histología obtener imágenes fiables de células de penacho (TCs). Este protocolo tiene tres puntos críticos: 1) el uso del sitio y fosforilación estado específico conejo anticuerpos policlonales contra humano girdin fosforiladas en tirosina 1798 (anticuerpos pY1798) que se obtuvieron de una determinada empresa ( Laboratorios Immuno-Biological = empresa X); 2) relleno de gelatina del yeyuno; y 3) recuperación de antígeno de baja temperatura. En el sentido más amplio, anticuerpos específicos para estado de fosforilación pueden calificarse como modificación específica anticuerpos que reconocen un tipo específico de modificación poste-de translación (por ejemplo, acetilación, metilación o fosforilación) de un proteínas en un residuo de aminoácido específico. Omori et al. empresa X generados conjuntamente anticuerpos pY1798 por inmunizar conejos con péptidos fosforilados y purificar los anticuerpos resultantes usando la cromatografía de fase sólida con un péptido unphosphorylated después método9, de Goto 10. anticuerpos pY1798 intensivo fueron validados con en vitro la fosforilación ensayos utilizando vectores de expresión girdin humana integral con o sin una mutación de punto en tirosina 17989. Posteriormente, Kuga et al encontró que anticuerpos pY1798 de la empresa X son un marcador específico y sensible de TCs intestinal1. Por lo tanto, inclusión de anticuerpos pY1798 de la empresa X es un punto crítico en este protocolo.
Gelatina contiene colágeno extraído de los tejidos animales y ha sido utilizada para muestras de tejido para estudios histoquímicos con cryosections13. Gelatina de bajo punto de fusión, que es gelatinizada a 4 ° C pero se funde a temperatura ambiente, comenzó a aplicarse para evitar los efectos adversos del calor necesario para mantener la gelatina en estado líquido durante la incrustación de14. En este protocolo, gelatina de bajo punto de fusión de polvo de la gelatina que gelatiniza a 4 ° C y funde a temperatura ambiente fue utilizado para preservar la morfología de los cryosections transversal del yeyuno ratón. Cuando esta gelatina se utilizó para llenar completamente el yeyuno, las muestras fueron entonces formalina-fijos para lograr la gelatinización irreversible. Recuperación de antígeno provocado por el calor es un método eficaz para exponer antígenos que son enmascarados por fijadores que contienen aldehídos12. Sin embargo, las altas temperaturas (95-99 ° C para 30 min) utilizadas para el análisis de secciones de la parafina pueden dañar la morfología de la compleja tejido/gelatina. Aquí utilizamos recuperación de antígeno de baja temperatura (50 ° C para 3 h) que permite la recuperación de antígeno y preservación de la morfología del tejido.
pY1798 anticuerpos pueden etiquetar TCs en yeyuno ratón, pero también en múltiples órganos (estómago, íleon, colon y vesícula biliar) de ratones y humanos1. Sin embargo, porque se degradará rápidamente señales de pY1798 en tejidos no fijadas de cualquier tejido, este protocolo incluye la inyección de formalina en el lumen yeyuno (paso 2.1.15., 1A figura2).
Existen limitaciones asociadas con el grueso de cryosections flotante. Aunque cryosections fina puede ser ventajoso en términos de translucidez para microscopía, la delgadez hace que estas secciones físicamente vulnerables. En cambio, cryosections gruesas son físicamente fuertes, pero tienen menor permeabilidad de anticuerpo en la sección. En este protocolo, se utilizaron 30 μm de espesor secciones que eran físicamente estable y permeable a los anticuerpos. Aunque este método fue diseñado por los investigadores sin experiencia en histología, si el protocolo falla, pY1798/bandido/DAPI triple tinción de parafina secciones similares a ése usado por Kuga et al. podría ser realizado1. Secciones de la parafina no se utilizaron aquí para evitar dificultades con phalloidin la coloración de la F-actina en secciones de parafina.
Debido a la conservación de secuencias de aminoácidos adyacentes girdin tirosina-1798, anticuerpos pY1798 pueden aplicarse para teñir TCs en especies distintas de ratón, incluyendo ratas y humanos. El relleno de gelatina usado en este protocolo también puede ser aplicado para otros órganos huecos. De hecho, aparte de pY1798 o TC, la combinación de gelatina relleno con recuperación de antígeno de baja temperatura puede ser útil para revelar notoriamente epitopos «difícil» en el intestino de ratón y como consecuencia, puede ser de interés para muchos investigadores.
Desconoce el papel biológico de girdin y el significado de su fosforilación en TCs. Sin embargo, un estudio realizado por Lin et al. sugerido que tirosina fosforilación de girdin se asocia con el grado de polimerización de actina F8. Mientras tanto, Kuga et al encontraron que letal dosis de inductores de apoptosis (e.g., cisplatino, rayos x) causó un gran aumento en la frecuencia relativa de TCs en el intestino de ratón que presume puede estar asociada con la posible conversión de enterocitos a TCs, en sincronización con la fosforilación de girdin en microvellosidades1. Esta posibilidad requiere investigación adicional en el futuro. Tres grupos recientemente observados rápidos aumentan en frecuencia de TC después de parásito infección15,16,17. Así, esta coloración flotante podría utilizarse no sólo para analizar los tejidos del intestino humano recogido endoscópicamente, pero también podría ayudar a la acumulación de TC en el diagnóstico de infección por parásitos en el intestino humano.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Naoya Asai en la Universidad de Nagoya para ofrecer sugerencias útiles para el desarrollo de la recuperación de antígeno de baja temperatura para secciones de yeyuno libre-flotación. Este trabajo fue apoyado por subvenciones para Scientific Research (KAKENHI) (C) en 2012 (JP25460493) y (B) en el año 2017 (JP17H04065) de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSP), un paso concede en 2014 (AS251Z02522Q) y en el 2015 (AS262Z00715Q) de la Japonesa de ciencia y tecnología agencia (JST) y un visionario Takeda investigación 2014 de Grant de la Fundación de ciencia de Takeda (para maestría).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slc:DDY 6-week-old female mice | Chubu Kagaku Shizai | Not applicable | |
| Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) | Wako | 196-02835 | |
| Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O | Wako | 199-02825 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Wako | 199-10665 | |
| Triton X-100, Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether | Katayama Chemical | Not applicable | |
| Sucrose | Wako | 190-00013 | |
| 10% buffered neutral formalin solution | Muto Chemical | 20215 | Step 1.3. |
| Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12381 | |
| Methanol | Nacalai Tesque | 21915-35 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| N.N-dimethylformamide (DMF) | Nacalai Tesque | 13015-75 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-10G | |
| 18-gauge stainless steel straight needle | Terumo | NN-1838R | |
| U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun | Kono Seisakusho | Not applicable | |
| 22-gauge winged needle | Terumo | SV-22DLK | |
| 20 mL TERUMO syringe | Terumo | SS-20ES | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 15 mL Iwaki centrifuge tubes | Iwaki | 2325-015 | |
| 1.5 mL micro test tube | Star | RSV-MTT1.5 | |
| Gelatin powder, Gelare-blanc | Nitta Biolab | 2809 | |
| Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece | Sakura FineTech | 4583 | |
| Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) | Shoei Work's | 1101-3 | |
| Isopentane | Nacalai Tesque | 26404-75 | |
| Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip | Corning | 353001 | |
| Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x | Dako | S2367 | Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2. |
| Protein Block | Dako | X0909 | Blocking solution in 4.2.5. |
| Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies | Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X | 28143 | Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6. |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 | Matsunami Glass | C022221 | |
| Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy | Merck Millipore | 107961 | |
| MAS-coated slide glass white | Matsunami Glass | MI-MAS-01 | |
| Wooden Mappe KO-type | Shoei Work's | 99-40007 | |
| Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml | Zeiss | 444960 | |
| Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) | Gilson | F144801, F123600, F123601, F123602 | |
| Ultrapure water production system | Advantec | GS-590 | |
| Plastic glove, Star Nitrile Glove | Star | RSU-NGVM | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1950 | |
| Deep freezer, SANYO Ultra Low | Sanyo | MDF-382 | |
| Showcase refrigerator | Nihon Freezer | NC-ME50EC | |
| Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) | Taitec | 0068750-000 | |
| Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) | Taitec | HB-100 | |
| Incubation chamber for immunostaining | Cosmo Bio | 10DO | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) | Taitec | NR-1 | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) | Tokyo Rika Kikai | MMS-3010 | |
| Stereoscopic microscope (for tissue handling) | Olympus | SZ61 | |
| Stereoscopic microscope (for Figure 1B) | Leica Microsystems | M165FC | |
| Fluorescence microscope (for Figure 3) | Nikon | E800 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Zeiss | LSM700 |
References
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