Summary
Mondeo et al. oppdaget at fosforylering status spesifikke antistoffer mot utgangen bindende protein girdin fosforylert på tyrosin 1798 (pY1798) kan brukes til å merke dusk celler (TCs). Denne protokollen lar robust visualisering av TCs bruke immunofluorescent farging av frittflytende jejunum cryosections med pY1798 antistoffer.
Abstract
Utgangen bindende protein girdin er en cytosolic proteiner som kreves for utgangen remodeling utløse celle migrasjon i ulike vev. Girdin er fosforylert både reseptor og ikke-reseptor tyrosin kinaser på tyrosin 1798. Omori et al. utviklet området- og fosforylering status-spesifikke antistoffer mot menneskelig girdin på tyrosin-1798 (pY1798), som spesifikt binder fosforylert tyrosin-1798, men ikke unphosphorylated tyrosin-1798. pY1798 antistoffer er brukt spesielt merke dusk celler (TCs) som finnes i pattedyr mage vev, men funksjonen til disse cellene er uklart. Denne protokollen gir robust visualisering av TCs i jejunum med pY1798 antistoffer og immunofluorescence. For å sikre vellykket og enkel TC visualisering, denne protokollen inneholder to histologiske teknikker: produksjon av frittflytende cryosections fra gelatin fylt jejunum vev og lav temperatur antigen henting ved 50 ° C i 3 h. fylle jejunum med gelatin opprettholder form av frittflytende deler gjennom flekker prosedyren, mens lav temperatur antigen henting sikrer robust signaler fra TCs. vellykket bruk av denne protokollen gir pY1798 farging av TCs distribuert fra villus tips krypten. Farget TCs har en spool-formet soma og fluorescerende signaler kondensere på lumenal spissen som tilsvarer den utstikkende "dusk." Phalloidin flekk colocalized med pY1798-positive TCs på fortykket Lyngen grensen, og tilsvarer en rootlet masse fra TC tuft. Denne protokollen kan brukes til å undersøke TCs i menneskelig biopsi prøver samlet med gastrointestinal endoskop. Videre rapportert TCs nylig å akkumulere følgende parasitt smitte i mus, tyder på at denne protokollen kan ha programmer for diagnostisering av parasitten infeksjoner i den menneskelige tarmen.
Introduction
Dusk celler (TCs) er mindre spredt gastrointestinal epithelia som kjennetegnes av apikale dusker og spool-formet somas1. Selv om TCs ble først beskrevet i 19562TC funksjon er fortsatt uklart, delvis på grunn av mangel på pålitelige TC markører.
Enomoto et al. først preget begrepsordbok bindende protein girdin3, som er uttrykt i nervesystemet og ikke-nevrale vev som blodkar, hjertet ventiler, sener og skjelettlidelser muskel4. Mus med genetisk ablation over girdin vise vekst retardasjon og flere hjernen anomalier4,5,6. I mellomtiden er tap-av-funksjon mutasjon i menneskelig girdin forbundet med progressive encefalopati, alvorlig retardasjon og tidlig utbruddet epileptiske anfall7.
I 2011 identifisert Lin et al. dynamisk fosforylering av girdin på tyrosin 1798 formidlet av tyrosin kinaser som EGFR og Src8. De viste også at fosforylert girdin kreves for utgangen remodeling utløse celle migrasjon8. Omori et al. utviklet området - og fosforylering status-spesifikke antistoffer mot menneskelig girdin fosforylert på tyrosin 1798 (pY1798 antistoffer) etter GOTOs protokoll, og godkjent antistoffer bruker nettstedet-rettet mutagenese av uttrykket vektorer bærer full lengde girdin9,10. I 2017, Mondeo et al. rapportert at pY1798 etiketter TCs med høy spesifisitet og høy følsomhet1. PY1798 antistoffer ble vist å være overlegen til forrige TC indikatorer basert på gode flekker egenskaper som avslørte figuren er hele cellen, inkludert karakteristiske "dusk" på den lumenal spissen, men biologiske rollen girdin og phospho-girdin i TC funksjonen forblitt uklart1.
Metoden beskrevet i denne studien innebærer immunofluorescence flekker, en histologiske teknikk for å markere et bestemt protein på vev med en primær antistoff mot et mål protein og en fluorescens-konjugerte sekundære antistoff mot primært antistoff. Formålet med denne metoden er å tillate forskere histologiske rydding hente høykvalitets TC bilder. Denne protokollen bruker frittflytende cryosections unngå behovet for lysbilde montert cryosections eller parafinen delen. Men frittflytende delene er skjøre fraværet av støtte fra et glass lysbilde og snittykkelsen kan minske antistoff permeabilitet. Denne protokollen inneholder to tilnærminger som overvinne disse problemene: 1) fylle hele jejunum lumen med gelatin å bevare morfologi av frittflytende deler gjennom flekker prosedyrene, og 2) bruk av lav temperatur antigen henting til intensivere pY1798 signaler.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av Animal Care og bruk komiteen ved Institutt for utviklingsmessige forskning, Aichi menneskelige servicesenter (programmet: M-03).
1. forberedelser
- Forberede 10 L fosfat bufret saltoppløsning (PBS): 32.27 g av Na2HPO4·12H2O, 4.5 g av NaH2PO4·2H2O, 80,0 g NaCl lagt til ultrapure vann til et endelig antall 10 L. Store løsning ved romtemperatur (RT).
- Forberede 200 mL PBS-T: 200 mL av PBS fra trinn 1.1 med 100 µL polyoxyethylene(10) octylphenyl Ether til en siste konsentrasjon på 0,05% (vol:vol). Butikken på RT.
- Mens iført hansker og vernebriller, forberede 50 mL av 15% sukrose i 10% bufret nøytral formalin løsning: 7.5 g av sukrose lagt til 10% bufret nøytral formalin løsning (Table of Materials) til et endelig antall 50 mL. Butikken på RT.
FORSIKTIG: Innånding og/eller huden/øye kontakt med formaldehyd i 10% bufret nøytral formalin løsning kan være farlig. Behandle med forsiktighet. - Forberede 1,5 mL 200 enheter/mL phalloidin-fluorescerende fargestoff konjugat lager løsning: phalloidin-fluorescerende fargestoff konjugert (300 enheter i 1 hetteglass, lyofilisert tørrstoff, eksitasjon og utslipp bølgelengder: 581 nm og 609 nm, henholdsvis) suspendert i 1,5 mL metanol. Lagre løsning i mørket på 20 ° C.
- Forberede 5 mg / mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) lagerløsning: 10 mg av DAPI i 2 mL av N, N-vannistedenfor (DMF). Lagre løsning i mørket på 20 ° C.
- Forberede 5% bovin serum albumin (BSA) i PBS: 0,5 g av BSA, 10 mL PBS. Butikken på 4 ° C.
- Fjerne skråkant spissen av en 18-gauge rett p bruker en nipper og knipe nipped slutten med en pincher langs retning slik at væsken å strømme gjennom nål lumen (figur 1A1).
Merk: Protokollen kan pauses her.
2. dyr disseksjon og isolering av Jejunum
- Perfusjon fiksering av mus
- Bruk hansker og arbeid i et godt ventilert område.
- Forberede en 100 mL glass beaker, 10% bufret nøytral formalin løsning, kirurgiske verktøy (saks, pinsett), en metallisk skuff, 6-0 nylon kuttet bildet, en 18-gauge rett p forberedt som 1.7, en 22-gauge bevingede nål, en 20 mL sprøyte.
- Laste 20 mL 10% bufret nøytral formalin løsning fra glass begeret til 20-mL sprøyte, og fest 22-gauge bevingede nålen på utløpet.
- Forbered flytende gelatin ved å legge 1 g av gelatin pulver til 20 mL PBS (siste 5% gelatin) i et 50-mL sentrifuge rør. Etter bløtlegging på RT i 15 min, ruge ved 50 ° C i et vannbad i 15 min uten risting.
- Kort virvelen, og Inkuber ved 50 ° C for en annen 15 min å løse gelatin. La røret på RT før bruk.
- Euthanize en voksen mus av cervical forvridning.
- Plasser musen fra trinn 2.1.6 på et metallisk brett og lag et lite innsnitt på huden gjennom ensiform brusken bruker kirurgiske redskaper.
- Utvid snittet med begge hender å avsløre de thoracic og abdominal regionene.
- Åpne peritoneum å avsløre mellomgulvet, og åpne deretter membranen på begge sider.
- Kutte thoracic buret langs de fremre axillaris linjene på begge sider, deretter fjerne thorax veggen ved å kutte i tverrgående retning ved thymus å avsløre hjertet.
- Lag et lite innsnitt i auricle av høyre atrium å tappe blod og en 22-gauge bevingede nål inn i toppen av venstre ventrikkel. Skyv stempelet perfuse vev med 10% bufret nøytral formalin løsning.
- Etter utsette organer i bekkenet, kuttet av slutten av endetarmen fra anus og skille tarmen fra kroppen ved å kutte i mesentery.
- For å isolere jejunum, kuttet tarmen på 4 cm fra anal siden med den mage antrum. Kast anal halvparten av gjenværende tynntarmen.
- Klipp jejunum i halvparten å lette rødme prosedyren. Last 20 mL 10% bufret nøytral formalin løsning i 20-mL sprøyte, og legge 18-gauge rett nålen forberedt i trinn 1.7 til stikkontakten.
- Sette inn 10% bufret nøytral formalin løsning fra den ene enden av den beskjærte jejunum å skylle ut intestinal innholdet og å fastsette gut lumen overflaten (figur 1A2).
- Vask gut lumen ved å injisere PBS som beskrevet i trinn 2.1.15.
- Tømme flytende gelatin i tarmen lumen som beskrevet i trinn 2.1.15 erstatte PBS med flytende gelatin.
- En slutten av den beskjærte jejunum av Sutur ligation med en 6-0 nylon cut Sutur, fylle jejunum med flytende gelatin og lukke den motsatte enden av Sutur ligatur (figur 1A3).
- Legge til fire Sutur knop tilpasses en pølse-formet jejunum inndeling i deprimert delen av en cryomold (figur 1A4).
Merk: For cryomolds med en 20 x 25 mm x 5 mm deprimert delen, en ~ 20 mm pølse-lignende jejunum delen er å foretrekke. - Suge vev i 50 mL av 15% sukrose i 10% bufret nøytral formalin løsning overnatting på 4 ° C.
Merk: Følgende kontroller cryoprotection av sukrose og protein fiksering av formalin gelatin og vev. Formalin-gelatinized gelatin smelter ikke på RT, mens ikke-fast gelatinized gelatin på 4 ° C smelter på RT.
3. Fest frysing av Gelatin fylt Jejunum vev
- Ved å klippe jejunum på Sutur knop, hentes pølse-lignende jejunum settet med begge ender samskrevet (figur 1A4). Juster pølse-lignende bitene i en cryomold for tillegg av innebygging sammensatte for utarbeidelse av frosne vevsprøver.
- Fest fryse cryomold i isopentane avkjølt med flytende nitrogen. Lagre cryomolds ved-80 ° C
Merk: Protokollen kan pauses her.
4. immunofluorescence av dusken celler med frittflytende Cryosections
- Og kryosnitt
- Angi både kryostaten kammertemperatur (CT) og objektet temperatur (OT) til-22 ° C. Stedet av frossent blokker i en cryomold i kryostatkammeret i minst 15 min.
- Legge til 3 mL PBS en 35 mm kultur parabol.
- Fjern frossent blokken fra cryomold og halvert blokken med et barberblad å avsløre den tverrstilt delen av jejunum. Montere en halv blokk på en chuck (en kryostaten adapter) til delen skjæringsplanet med razor blad.
- Delen gelatin fylt jejunum i 30 µm tykke seksjoner. Bruk frosset tang forsiktig overføre delene til 35 mm kultur parabolen utarbeidet i trinn 4.1.2 (figur 2Bhøyre).
- Anvendelse av primære antistoffer
- Vask frittflytende inndelingene i 35 mm kultur parabol 3 ganger i 5 min hver med 3 mL PBS-T med mild rister på en gjensidig shaker (ca 36 ganger / min).
- Forberede antigen henting løsning: 0,3 mL av antigen henting vaskeløsningen (Tabell for materiale) i 2,7 mL ultrapure vann. Legge 3 mL antigen henting løsning til 35 mm kultur parabol med frittflytende deler.
- Lukk dekslet, tette gapet mellom rett og lokket med en stripe av vinyl tape og ruge ved 50 ° C i en hybridisering inkubator for 3t uten risting.
- Fjerne retten fra inkubatoren og kule på RT for 20 min. Fjerne vinyl tape, vaskes delene 3 ganger i 5 min hver med 3 mL PBS-T og mild risting.
- Sug opp PBS-T og legge 5 dråper blokkerer løsning (Tabell for materiale) på delene. Ruge på RT i 5 min med mild risting.
- Forberede den primære antistoff løsningen: 495 µL av 5% BSA i PBS med 5 µL av phospho-Y1798 girdin (pY1798) antistoffer (Tabell for materiale). Legg til 500 µL av primære antistoff løsning på delene (blokkerer løsningen ikke trenger fjernes).
- Plasser rett i en fuktet inkubasjon kammer og ruge over natten ved 4 ° C med mild risting.
Merk: Den natten inkubering kan utvides til opptil tre netter.
- Bruk av sekundære antistoffer
- Vask delene 3 ganger i 5 min hver i 3 mL av PBS-T med mild risting.
- Forberede utvannet DAPI lager løsning: 2 µL DAPI lager løsning (trinn 1.5), 998 µL av PBS.
- Lage sekundære antistoff løsning: 476 µL av 5% BSA i PBS, 10,5 µL av fortynnet DAPI løsning, 12.5 µL av phalloidin-fluorescerende fargestoff konjugat lagerløsning, 1 µL av geit anti-kanin IgG-fluorescerende fargestoff konjugert (bølgelengde: eksitasjon 496 nm, utslipp 520 nm).
- Aspirating på PBS-T, bruke den sekundære antistoff løsningen og ruge i en lys skjermede inkubasjon kammer på RT for 30 min med mild risting.
- Vask delene 3 ganger i 5 min hver med 3 mL PBS-T og mild risting.
- Etter siste vask, fjerne PBS-T og erstatte med 3 mL PBS mangler polyoxyethylene(10) octylphenyl ether. Overføre retten til stereoskopisk mikroskop.
- Sted 200 µL av PBS i et slippverktøy på midten av en MAS-belagt hvitt glass lysbilde og overføre en jejunum delen fra parabolen i slippverktøyet bruker et P200 Pipetter tips.
- Sug opp alle gjenværende PBS rundt delen etter justering delen justering under stereoskopisk mikroskopet.
- Legge til 20 µL av vandig monterer medier og plassere en 20 x 20 mm dekkglassvæske på mediet.
- Umiddelbart forsegle dekkglassvæske kantene med xylen-baserte monterer medier. Plasser lysbildet på et tre mappe og la xylen-baserte montering media å størkne på RT 2-3 h.
Merk: Protokollen kan pauses her. Etter xylen-baserte montering media stivner, kan lysbildene lagres i 2-3 uker i en lys skjermede lysbildet på RT.
5. AC confocal mikroskopi
- Sette neddyppingsolje på 63 X målet med AC confocal mikroskop. Senker dekkglassvæske-lysbildet og plasser lysbildet på scenen.
- Digitalisere TC bildene kjøpt til laser bølgelengder 405, 488 og 555 nm og lagre bilder i tiff-format (TIFF).
Merk: Velge en gjenkjenning filter som passer for fluorescens fargestoffer (dvs. eksitasjon/utslipp maxima: 358/461 nm, 490/525 og 590/617).
Representative Results
Gelatin-fylling av jejunum
En vanlig prosedyre for å fylle musen jejunum med gelatin vises (figur 1A), som er fordelene med gelatin fyller (figur 1B). I korthet, var skrå spissen av en 18-gauge rett p fjernet for å beskytte mot piercing gut veggen (figur 1A1). Gelatin fylling var oppnådd, med 10% bufret nøytral formalin løsning injiseres fra én ende av en avkuttet jejunum del å tømme tarmen og fikse gut lumen overflaten (figur 1A2) før fyller med flytende gelatin ( ) Figur 1A3). De resulterende pølse-lignende stykker (figur 1A4) var innebygd, frosset og tvers delt i 30 µm tykke skiver i en kryostaten. I fravær av fylle, pleier jejunal deler å kink, slik at villi svinger bakover (figur 1Bvenstre). Gelatin fylling bevarer runde plate-form av delene og opprettholder stående plassering av villi (figur 1Bhøyre). Bildene viser tydelig fordel by av gelatin fylle ut bevare morfologi av frittflytende jejunum deler.
Vellykket imaging intestinal dusk celler
pY1798 antistoffer kan brukes til variable immunostai-teknikker, inkludert dot blotting vestlige blotting, parafin delen flekker, Tin-montert cryosection flekker og frittflytende cryosection flekker1,9. I denne protokollen fokuserte vi på frittflytende cryosections til fluorescens farging av TCs i musen jejunum pY1798 antistoffer, phalloidin og DAPI flekker for å demonstrere strukturelle egenskapene til TCs1. Generelt, er TCs spredt med en hastighet på ca en TC/100 epitelceller fra villus tips til krypten1. Representant resultatene viser at pY1798 reproduserbar delineates hele TCs, inkludert membranen, cytoplasma spool-formet soma og sterkt farget lumenal spissen, der robust signal kondens tilsvarer den utstikkende "dusk" av en TC1 (Figur 2A-2B). I mellomtiden phalloidin er en phallotoxin, en familie av giftige bisyklisk heptapeptides fra mushroom fluesopp, og har høy affinitet for trådformede utgangen (F-utgangen), som finnes i microvilli som danner intestinal Lyngen grensen 11. Phalloidin reproduserbar og fremtredende markerer fortykket Lyngen grensen som tilsvarer en masse rootlets strekker seg fra dusk1. Dermed viser den konsekvente co lokaliseringen av pY1798 signaler (spool-formet soma, signalet kondens på lumenal spissen) med fremtredende fortykket phalloidin-positive Lyngen grensen at denne protokollen vellykket identifiserer TCs uavhengig av om de er på en villus ()figur 2A) eller i en krypt ()finne 2B).
Lav temperatur antigen henting er effektiv til farging frittflytende deler
Varme-baserte antigen henting på 95-99 ° C er mye brukt for analyse av parafinsnitt og lysbilde montert cryosections. Men er å bruke denne tilnærmingen til frittflytende deler uten å forårsake skade vanskelig fordi slike inndelinger er vanligvis mer sårbare enn lysbilde montert seksjoner som støttes av lysbildet12. Siden lav temperatur antigen henting (50 ° C 3 h) ved hjelp av et vannbad ikke påvirke morfologi av frittflytende jejunum deler foreløpige eksperimenter, vi vurdert objektive effektiviteten av antigen henting i en blind test, som Statistisk bekreftet effektiviteten av lav temperatur antigen henting ()Figur 3).
Figur 1: Gelatin fylling av jejunum seksjoner for morfologiske bevaring av cryosections
(A) bilder av prosedyrer for intraluminal fylling av musen jejunum med gelatin. (A1) Skrå spissen av en 18-gauge rett p var fjernet for å unngå piercing gut veggen. (A2) Bufrede nøytral formalin løsning (10%) ble injisert i den ene enden av den beskjærte jejunum å rødme intestinal innholdet og fikse gut lumen overflaten. (A3) Beskjærte jejunum fylt med flytende gelatin og begge ender samskrevet bruke en 6-0 nylon Sutur (svart piler). (A4) Fire flere Sutur knop (hvite piler) mellom eksisterende Sutur knop (svart piler) gitt tre kortere stykker. Vevet vil deretter bli delt i tre pølse-lignende stykker på to angitte posisjoner (hvit pilspisser). (B) gunstige effekter av gelatin fyller på frittflytende cryosection morfologi. Uten gelatin fylling pleier deler å kink, slik at villi lett svinger bakover (venstre); med gelatin fylling, en 30 µm tykke delen opprettholder en plate figur og stående av villi er bevart (høyre). Bildene ble fotografert med Nomarski differensial forstyrrelser kontrast. Skalere barer, 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant fluorescens bilder av musen intestinal dusk celler
AC confocal fluorescens bilder av TCs på en villus (A) eller i en krypt (B)i frittflytende musen jejunum deler farget med områdespesifikke og fosforylering-status-spesifikke antistoffer mot girdin fosforylert på tyrosin 1798 ( pY1798, grønn, optimal eksitasjon/utslipp bølgelengder 490/525 nm), phalloidin (rød, 590/617 nm), 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, blå, 358/461 nm). Området omgitt av hvite bokser i lav forstørrelse bilder (skala barer, 50 µm) er utvidet til høyre (skala barer, 10 µm). pY1798 antistoffer flekken reproduserbar TCs, uansett plassering (på en villus (A), eller i en krypt (B)), med flekker tilstede på lumenal tips (piler), membran og cytoplasm i spool-formet TC soma. En fremtredende fortykket brush-grensen i phalloidin flekker (pilspisser) er en annen karakteristiske tegn på TCs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Lav temperatur antigen henting forbedrer pY1798 immunofluorescence
To grupper av eksperimentelle prosedyrer ble sammenlignet med bekrefte effektiviteten av lav temperatur antigen henting. Frittflytende jejunum deler (30 µm tykk, n = 13) fra en enkelt frosne blokk ble delt i to grupper, og deler fra hver gruppe ble farget følger komplett protokollen eller samme protokoll mangler lav temperatur antigen henting (trinn 4.2.2). Etter avsnitt ble montert på enkeltlysbilder merket med gruppe, og merkingen på hvert lysbilde var dekket med maskeringstape. Alle lysbildene var stokkes, merket med nye numre på båndet, og observert under fluorescens mikroskopi gjennom et FITC-filter. Totalt antall synlige pY1798-positive TCs var gjennomsnitt i hver gruppe, og ble vist i et stolpediagram (gjennomsnittlig ± standardavvik). En tosidig t-test ble utført for å sammenligne gjennomsnittlig teller mellom de to gruppene. P-verdier under 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Lav temperatur antigen henting forbedret effektiviteten av pY1798-immunofluorescence. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Denne protokollen ble utformet slik at forskere uten histology erfaring å få pålitelige bilder av dusk celler (TCs). Denne protokollen har tre kritiske punkter: 1) bruk av nettstedet- og fosforylering status-spesifikke kanin polyklonale antistoffer mot menneskelig girdin fosforylert på tyrosin 1798 (pY1798 antistoffer) som ble Hentet fra en bestemt selskap ( Immuno-Biological Laboratories = selskapet X); 2) gelatin fylling av jejunum; og 3) lav temperatur antigen henting. I videste forstand, fosforylering status-spesifikke antistoffer kan kategoriseres som endring-spesifikke antistoffer som gjenkjenne en bestemt type post-translasjonell modifikasjon (f.eks acetylation, metylering eller fosforylering) av en protein på en bestemt aminosyre rester. Omori et al. og selskapet X fellesskap generert pY1798 antistoffer immunisere kanin med fosforylert peptid og rensende resulterende antistoffer solid-fase kromatografi med en unphosphorylated peptid etter GOTOs metode9, 10. pY1798 antistoffer var intenst godkjent med i vitro fosforylering analyser ved hjelp av full lengde menneskelige girdin uttrykk vektorer med/uten en punkt mutasjon tyrosin 17989. Deretter funnet Mondeo et al. at pY1798 antistoffer fra selskapet X er en bestemt og følsom markør intestinal TCs1. Således, inkludering av pY1798 antistoffer fra selskapet X er et kritisk punkt i denne protokollen.
Gelatin inneholder kollagen Hentet fra dyr vev og har lenge vært brukt bygge inn vevsprøver for histochemical studier med cryosections13. Lav-smelte-punktet gelatin, som er gelatinized på 4 ° C, men smelter ved romtemperatur, begynte brukes for å unngå bivirkninger av varme nødvendig for å opprettholde gelatinen i flytende form under innebygging14. I denne protokollen, ble lav-smelte-punktet gelatin laget av gelatin pulver som gelatinizes på 4 ° C og smelter på RT brukt til å bevare morfologi av tverrgående cryosections av musen jejunum. Når denne gelatin ble brukt til å fylle jejunum, var prøvene så formalin-fast å oppnå irreversibel gelatinization. Varme-indusert antigen henting er en effektiv metode for å avsløre antigener som blir maskert av aldehyd inneholder fiksativene12. Men kan de høye temperaturene (95-99 ° C i 30 min) brukte for analyse av parafinsnitt skade morfologi av vev/gelatin komplekse. Her brukte vi lav temperatur antigen henting (50 ° C 3 h) som gjør at både antigen henting og bevaring av vev morfologi.
pY1798 antistoffer kan merke TCs ikke bare i musen jejunum, men også i flere organer (magen, ileum, kolon og galleblæren) fra mus og mennesker1. Men fordi pY1798 signaler i unfixed vev fra alle typer vev vil raskt forringe, denne protokollen inkluderer formalin injeksjon i jejunum lumen (trinn 2.1.15., figur 1A2).
Det er begrensninger knyttet til tykkelsen på frittflytende cryosections. Selv om tynne cryosections kan være gunstig i form av gjennomskinnelighet for mikroskopi, gjør thinness inndelingene fysisk sårbare. I kontrast, tykk cryosections er fysisk solid, men har lavere antistoff permeabilitet i delen. I denne protokollen, 30 µm tykke delene ble brukt som var både fysisk stabil og permeable til antistoffer. Selv om denne metoden ble utviklet for forskere uten erfaring i histology, hvis protokollen skal mislykkes, inndelinger pY1798/villin/DAPI trippel farging av parafin som brukes av Mondeo et al. kunne utføres1. Parafinsnitt ble ikke brukt her å unngå vanskelighetene knyttet phalloidin farging av F-utgangen i parafinsnitt.
På grunn av bevaring av amino acid sekvenser ved girdin tyrosin-1798, kan pY1798 antistoffer brukes til stain TCs i arter enn mus, inkludert rotte og menneske. Gelatin fylling i denne protokollen kan også brukes for andre hul organer. Faktisk, bortsett fra pY1798 eller TC kombinasjonen av fylle med lav temperatur antigen henting kan være nyttig for å avsløre notorisk "vanskelige" epitopes i musen-tarmen, og som en konsekvens, kan være av interesse for mange forskere.
Biologiske rollen girdin og betydningen av sin fosforylering i TCs er uklart. Men en studie av Lin et al. foreslo at tyrosin fosforylering av girdin er forbundet med graden av F-utgangen polymerisasjon8. I mellomtiden Mondeo et al. funnet at dødelige doser av apoptose indusere (f.eks., cisplatin, røntgen stråling) forårsaket en stor økning i den relative hyppigheten av TCs i tynntarmen mus som de hypotetiske kan være assosiert med den mulig konvertering fra enterocytes til TCs, i synkronisering med fosforylering av girdin i microvilli1. Denne muligheten vil kreve ytterligere undersøkelse i fremtiden. Tre grupper nylig observert rask økning i TC frekvens etter parasitt smitte15,16,17. Derfor denne frittflytende flekker kan brukes ikke bare til å analysere vanndampsteri samlet menneskelige tarmen vev, men TC opphopning kan også hjelpe i diagnosen parasitt smitte i den menneskelige tarmen.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Naoya Asai ved Nagoya University for å gi nyttig forslag for utviklingen av lav temperatur antigen henting for frittflytende jejunum deler. Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI) (C) i 2012 (JP25460493) og (B) i 2017 (JP17H04065) fra Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER), gir A-trinn i 2014 (AS251Z02522Q) og i 2015 (AS262Z00715Q) fra den Japan vitenskap og teknologi Agency (JSO) og en Takeda visjonær forskning Grant 2014 fra Takeda Science Foundation (til ma).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slc:DDY 6-week-old female mice | Chubu Kagaku Shizai | Not applicable | |
| Disodium hydrogenphosphate 12-water (Na2HPO412H2O) | Wako | 196-02835 | |
| Sodium dihydroenphosphate Dihydrate (NaH2PO42H2O | Wako | 199-02825 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Wako | 199-10665 | |
| Triton X-100, Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether | Katayama Chemical | Not applicable | |
| Sucrose | Wako | 190-00013 | |
| 10% buffered neutral formalin solution | Muto Chemical | 20215 | Step 1.3. |
| Phalloidin-fluorescent dye conjugate, Alexa Fluor 594 phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12381 | |
| Methanol | Nacalai Tesque | 21915-35 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| N.N-dimethylformamide (DMF) | Nacalai Tesque | 13015-75 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647-10G | |
| 18-gauge stainless steel straight needle | Terumo | NN-1838R | |
| U.S.P. 6-0, 60 cm nylon cut suture, Crownjun | Kono Seisakusho | Not applicable | |
| 22-gauge winged needle | Terumo | SV-22DLK | |
| 20 mL TERUMO syringe | Terumo | SS-20ES | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 15 mL Iwaki centrifuge tubes | Iwaki | 2325-015 | |
| 1.5 mL micro test tube | Star | RSV-MTT1.5 | |
| Gelatin powder, Gelare-blanc | Nitta Biolab | 2809 | |
| Embedding compound for frozen tissue specimen, O.C.T. Compound 118 mL 12 piece | Sakura FineTech | 4583 | |
| Cryomold, CRYO DISH No. 3, 125 piece, well size 20 x 25 x 5 (mm) | Shoei Work's | 1101-3 | |
| Isopentane | Nacalai Tesque | 26404-75 | |
| Falcon cell culture dish 35 x 10mm Easy-Grip | Corning | 353001 | |
| Antigen retrieval solution concentrate, Target Retrieval Solution pH 9 10x | Dako | S2367 | Antigen retrieval solution concentrate in step 4.2.2. |
| Protein Block | Dako | X0909 | Blocking solution in 4.2.5. |
| Phospho-Y1798 girdin (pY1798) antibodies | Immuno-Biological Laboratories (IBL) = Company X | 28143 | Phospho-Y1798 girdin antibodies in step 4.2.6. |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| Aquous mounting media, Prolong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36930 | |
| Coverslips, Matsunami Micro Cover Glass 22 x 22 mm 100 pcs Thickness No.1 | Matsunami Glass | C022221 | |
| Entellan New, xylene-based mounting media for microscopy | Merck Millipore | 107961 | |
| MAS-coated slide glass white | Matsunami Glass | MI-MAS-01 | |
| Wooden Mappe KO-type | Shoei Work's | 99-40007 | |
| Immersion Oil 518 F Fluorescence Free 20 ml | Zeiss | 444960 | |
| Pipettes, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000) | Gilson | F144801, F123600, F123601, F123602 | |
| Ultrapure water production system | Advantec | GS-590 | |
| Plastic glove, Star Nitrile Glove | Star | RSU-NGVM | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1950 | |
| Deep freezer, SANYO Ultra Low | Sanyo | MDF-382 | |
| Showcase refrigerator | Nihon Freezer | NC-ME50EC | |
| Water bath, Thermominder SDminiN (to dissolve gelatin at 50 C) | Taitec | 0068750-000 | |
| Hybridization incubator (for antigen retrieval at 50 C) | Taitec | HB-100 | |
| Incubation chamber for immunostaining | Cosmo Bio | 10DO | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for room temperature) | Taitec | NR-1 | |
| Reciprocal shaker for immunohistochemistry (for 4 C) | Tokyo Rika Kikai | MMS-3010 | |
| Stereoscopic microscope (for tissue handling) | Olympus | SZ61 | |
| Stereoscopic microscope (for Figure 1B) | Leica Microsystems | M165FC | |
| Fluorescence microscope (for Figure 3) | Nikon | E800 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Kuga, D., et al. Tyrosine phosphorylation of an actin-binding protein Girdin specifically marks tuft cells in human and mouse gut. J Histochem Cytochem. 65 (6), 347-366 (2017).
- Jarvi, O., Keyrilainen, O. On the cellular structures of the epithelial invasions in the glandular stomach of mice caused by intramural application of 20-methylcholantren. Acta Pathol Microbiol Scand Suppl. 39 (Suppl 111), 72-73 (1956).
- Enomoto, A., et al. Akt/PKB regulates actin organization and cell motility via Girdin/APE. Dev Cell. 9 (3), 389-402 (2005).
- Asai, M., et al. Similar phenotypes of Girdin germ-line and conditional knockout mice indicate a crucial role for Girdin in the nestin lineage. Biochem Biophys Res Commun. 426 (4), 533-538 (2012).
- Kitamura, T., et al. Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin. Nat Cell Biol. 10 (3), 329-337 (2008).
- Wang, Y., et al. Girdin is an intrinsic regulator of neuroblast chain migration in the rostral migratory stream of the postnatal brain. J Neurosci. 31 (22), 8109-8122 (2011).
- Nahorski, M. S., et al. CCDC88A mutations cause PEHO-like syndrome in humans and mouse. Brain. 139 (Pt 4), 1036-1044 (2016).
- Lin, C., et al. Tyrosine Phosphorylation of the G alpha-Interacting Protein GIV Promotes Activation of Phosphoinositide 3-Kinase During Cell Migration. Science signaling. 4 (192), ra64 (2011).
- Omori, K., et al. Girdin is phosphorylated on tyrosine 1798 when associated with structures required for migration. Biochem Biophys Res Commun. 458 (4), 934-940 (2015).
- Goto, H., Inagaki, M. Production of a site- and phosphorylation state-specific antibody. Nat Protoc. 2 (10), 2574-2581 (2007).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Jiao, Y., et al. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections. J Neurosci Methods. 93 (2), 149-162 (1999).
- Feltkamp-Vroom, T. M., Boode, J. H. An embedding and sectioning technique for immunohistochemical studies of minute specimens of tissue. J Clin Pathol. 23 (2), 188-189 (1970).
- Ushida, K. Pre-embedding technique with low melting temperature gelatin for preparation of histological sections. Proceeding of the Annual Meeting on Technologies in Biological Research. 36, 66-69 (2014).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
- von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
- Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
