تفاعلات البروتين البروتين والبروتين-المستقلب حاسمة بالنسبة لجميع الوظائف الخلوية. هنا، نحن وصف بروتوكول يسمح تحليل موازية لهذه التفاعلات مع بروتين في الاختيار. لدينا بروتوكول الأمثل للثقافات الخلية النباتية، ويجمع بين انجذاب تطهير مع البروتين الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي وكشف المستقلب.
وتخضع العمليات الخلوية بالتفاعلات بين الجزيئات البيولوجية مثل البروتينات ونواتج الأيض والأحماض النووية. بينما يتم التحقيق في تفاعلات البروتين البروتين (PPI) لا الجدة، نهج تجريبي يهدف إلى وصف التفاعلات الذاتية البروتين-المستقلب (PMI) تشكل تطورا الأخيرة بدلاً من ذلك. وهنا، نقدم بروتوكول يسمح لتوصيف المتزامنة PPI والصليب الأحمر من بروتين اختيارهم، ويشار إليها كطعم. لدينا بروتوكول كان الأمثل لخلية نبات الثقافات ويجمع بين انجذاب تطهير (AP) مع الطيف الكتلي (مللي ثانية)-على أساس الكشف عن البروتين والمستقلب. باختصار، أولاً يتم تفكيك خطوط نبات المحورة وراثيا، معربا عن البروتين الطعم تنصهر فيها علامة تقارب، للحصول على خلاصة خلوية أصلية. وتستخدم الأجسام المضادة العلامة لهدم البروتين والمستقلب الشركاء من البروتين الطعم. المجمعات تنقية تقارب يتم استخراج استخدام الميثيل خطوة واحدة ثالثي-بوتيل الاثير (مثيل ثالثي بوتيل الإيثر)/الميثانول/المياه الأسلوب. بينما فصل نواتج الأيض إلى القطبية أو في مرحلة مسعور، يمكن العثور على البروتينات في بيليه. ثم يتم تحليل نواتج الأيض والبروتينات بواسطة فائقة الأداء السائل اللوني-قياس الطيف الكتلي (أوبلك–مرض التصلب العصبي المتعدد أو أوبلك-MS/MS). متجه فارغة (EV) مراقبة خطوط تستخدم لاستبعاد المغلوطة. والميزة الرئيسية لأن البروتوكول أنه يمكن تحديد شركاء البروتين والمستقلب البروتين المستهدف بالتوازي في ظروف القرب الفسيولوجية (الخلوية ليستي). طريقة عرض واضحة وسريعة، ويمكن تكييفها بسهولة للنظم البيولوجية خلاف الثقافات الخلية النباتية.
الأسلوب الموصوفة هنا يهدف إلى تحديد الشركاء المستقلب والبروتين بروتين الاختيار في ظروف شبهفي فيفو ليساتي الخلوية. كان قد تردد أن العديد من نواتج الأيض أكثر مما يتسم اليوم وظيفة تنظيمية هامة1. والايضات يمكن أن تعمل كمفاتيح البيولوجية، تغيير في النشاط ووظائف الترجمة على مستقبلات بروتينات2،،من34. وكانت أساليب اختراق عدة، مما يتيح تحديد الهوية من PMI في فيفو أو في ظروف شبهفي فيفو ، في العقد الماضي نمواً5. يمكن فصل النهج المتاحة إلى مجموعتين. وتضم المجموعة الأولى التقنيات التي تبدأ ب طعم المستقلب المعروفة بغية تعويض البروتين رواية الشركاء. وتشمل أساليب التقارب اللوني6والمخدرات تقارب الاستقرار المستهدفة تستجيب المقايسة7، البروتيوميات الكيماوي8والبروتين الحرارية التنميط9. تتكون المجموعة الثانية من أسلوب واحد يبدأ مع بروتين معروفة من أجل تحديد يغاندس جزيء صغير10،11.
AP يقترن المستندة إلى MS ليبيدوميكس استخدمت لتحليل البروتينات الدهنية المجمعات في. Saccharomyces cerevisiae12 كنقطة انطلاق، المؤلفين استخدام سلالات الخميرة معربا عن 21 الإنزيمات المشاركة في تخليق ارجوستيرول الحيوي وتنصهر مؤنزم 103 على تنقية جنبا إلى جنب-تقارب العلامة (الصنبور). تم العثور على 70% الإنزيمات و 20% من مؤنزم لربط مختلف يغاندس مسعور، تسليط الضوء في شبكة التفاعل المعقدة البروتينات الدهنية.
سابقا، يمكن أن نظهر أن، وبالمثل للدهون، المركبات القطبية وشبه القطبية أيضا تظل ملتزمة بمجمعات البروتين المعزولة من ليساتيس الخلوية13. وبناء على هذه النتائج، قررنا أن تحسين وكالة اسوشييتد برس الأسلوب سبق نشرة10،11 للخلايا النباتية ومجمعات ماء14. ولهذا الغرض، استخدمنا ناقلات الصنبور الموصوفة بلين فإن وآخرون 2010، استخدمت بنجاح في مصنع PPI الدراسات15. لتقصير الفترة الزمنية اللازمة للحصول على خطوط محوره وراثيا، قررنا نبات خلية الثقافات. نحن العاملين خطوة واحدة الميثيل ثالثي-بوتيل الاثير، (مثيل ثالثي بوتيل الإيثر)/الميثانول/المياه استخراج أسلوب، مما يتيح وصف البروتينات (بيليه)، والدهون (المرحلة العضوية)، وماء الأيض (المرحلة المائية)16 في واحد تنقية تقارب التجربة. وأدخلت خطوط التحكم EV استبعاد إيجابيات كاذبة، مثل البروتينات ملزمة للعلامة وحدها. وكدليل على مفهوم نحن معلم ثلاثة (من خمسة) نوكليوزيد diphosphate مؤنزم الموجودة في جينوم نبات (NDPK1-NDPK3). من بين النتائج الأخرى، يمكن أن نظهر أن NDPK1 يتفاعل مع الجلوتاثيون S-ترانسفيراز والجلوتاثيون. وبالتالي يمكن أن نثبت أن تعرض NDPK1 إلى جلوتاثيونيليشن14.
خلاصة القول، هو أداة هامة لوصف البروتين-بروتين وشبكات التفاعل جزيء صغير البروتين-البروتوكول المقدم ويشكل تقدما كبيرا على مدى الأساليب القائمة.
يسمح البروتوكول قدم موازية الهوية مجمعات PP وبعد الظهر للبروتين الهدف. من الاستنساخ للنتائج النهائية، يمكن أن تكتمل التجربة في أقل من 8-12 أسبوعا. AP كاملة يأخذ حوالي 4-6 ح لمجموعة من العينات 12 إلى 24، مما يجعل لدينا بروتوكول مناسبة لتحليل الإنتاجية منتصف.
البروتوكول، على الرغم من كونها واضحة عموما، يحتوي على عدد من الخطوات الحاسمة. (ط) يكفي كمية البروتين الإدخال والخرز تقارب أمر حاسم للتوصل إلى مجموعة ديناميكية من كشف المستقلب. ولذلك تحلل الخلية فعالة خطوة حاسمة في الإجراء. يمكن أن تكون غلة بروتين الفقراء نتيجة لنضح غير كافية من المواد أو نسبة تحلل-المواد العازلة دون المستوى الأمثل. (ثانيا) ينبغي الحرص أن الكواشف المستخدمة هي صديقة لمرض التصلب العصبي المتعدد. وينبغي تجنب المنظفات القوية أو الجلسرين، أو كميات مفرطة من الملح كما أنها تتعارض مع الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. (ثالثا) الخرز [اغروس] ينبغي أن لا الإفراط المجفف أثناء الغسيل الخطوات، وعند استخدام مشعب فراغ من المهم تطبيق معدل تدفق بطيء حتى لا تدمير الخرز أو تؤثر على الاستقرار المعقدة.
وهناك بعض التعديلات المحتملة الهامة في البروتوكول المقدم: (ط) نستخدم المروج CaMV35S التأسيسي لزيادة كمية البروتين الطعم. Overexpression، كانت مفيدة جداً، يمكن أن يكون آثار خطيرة على التوازن خلية28 وأن يؤدي إلى تشكيل تفاعلات غير ذات صلة من الناحية الفسيولوجية. تعبير البروتينات المعلمة استخدام المروجين الأصلية والتي يعتبر فيها ممكن في خلفية فقدان لوظيفة متفوقة لاسترداد التمثيلات البيولوجية الحقيقية. للبروتينات عادة لا المعرب عنه في الثقافات الخلية النباتية، قد يثبت خلفية النباتية اللازمة لتحديد التمثيلات ذات الصلة. (ثانيا) عند العمل مع بروتينات الغشاء, المخزن المؤقت تحلل يحتاج إلى أن تستكمل بالمنظفات الصناعية متوافقة مع مرض التصلب العصبي المتعدد. (ثالثا) الأخذ بخطوة تقارب تنقية ثانية يمكن تحسين إيجابيات كاذبة بالنسبة الحقيقية من إيجابيات والقضاء على الحاجة إلى ضوابط EV29. علامة رواية جنبا إلى جنب مع موقعين حوزتي المستقلة-الانقسام ويقدم بديلاً جذاباً للخطوة حجم الاستبعاد اللوني يضيفها مايدا et al. عام 201411، وشاقة وتستغرق وقتاً طويلاً على حد سواء.
العائق أخطر من وكالة اسوشييتد برس هي المعدل المرتفع من إيجابيات كاذبة. أسباب عديدة. سبق أن ورد overexpression التأسيسي. مصدر آخر للتفاعلات غير ذات صلة من الناحية الفسيولوجية، ما لم يكن العمل مع العضيات معزولة، إعداد ليساتيس كامل الخلية التي تحتوي على خليط من البروتينات ونواتج الأيض من المقصورات سوبسيلولار مختلفة. وينبغي استخدام التعريب سوبسيلولار لتصفية للتمثيلات الحقيقية. ومع ذلك، نتيجة أغلبية المغلوطة ملزمة غير محدد بين البروتينات والراتنجات [اغروس]. مقدمة لتنقية الخطوة الثانية، كما هو موضح أعلاه، يقدم أفضل حل للمشكلة، لكن يأتي على حساب الوقت والإنتاجية. وعلاوة على ذلك، قد يتم فقدان التفاعل أضعف كما يطيل البروتوكول. تحذير آخر من وكالة اسوشييتد برس هو رغم شاملة المعلومات التي يقدمها حول إينتيراكتومي البروتين المستهدف، التفريق بين الأهداف المباشرة وغير المباشرة من البروتين اصطاد مستحيلة. النهج بيموليكولار المستهدفة ضرورية لتأكيد التفاعلات.
AP مقترنة بجميع المستندة إلى MS استخدمت لدراسة البروتين-المجمعات في S. cerevisiae12. هذا العمل، جنبا إلى جنب مع جهودنا الملاحظة السابقة13 ، وبالمثل للدهون، المركبات القطبية وشبه القطبية تظل ملتزمة بمجمعات البروتين المعزولة من ليساتيس الخلوية، وفرت الأساس المفاهيمي للبروتوكول المقدم. لدينا بروتوكول تتميز بثلاث نقاط فريدة من نوعها: (ط) وفي المقابل للخميرة العمل12، فإنه يوضح أن AP مناسبة لاسترجاع ليس فقط البروتين مسعور ولكن أيضا ماء يغاندس. (ثانيا) عن طريق إدخال بروتوكول استخراج ثلاثة في واحد، يمكن استخدام نقطة واحدة لدراسة البروتين والمستقلب التمثيلات من البروتين الطعم. (ثالثا) علينا تكييف البروتوكول الخلايا النباتية.
الجهود المقبلة ستركز على إنشاء علامة جديدة جنبا إلى جنب مع موقعين الانقسام حوزتي مستقلة. ونود أيضا لاستكشاف مدى ملاءمة البروتوكول إلى جزيئات صغيرة منخفضة-وفرة مثل الهرمونات النباتية.
The authors have nothing to disclose.
أننا نود أن يرجى نقر أ. د. لوثار ويلميتزير لمشاركته في المشروع، وإجراء مناقشات مثمرة، وإشراف كبير. ونحن ممتنون للدكتور دانييل Veyel لمساعدة مع قياسات MS البروتين. ونحن نقدر السيدة Änne ميكايليس الذين قدموا لنا المساعدة التقنية لا تقدر بثمن مع قياسات LC-مرض التصلب العصبي المتعدد. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر الدكتورة مونيكا كوسماكز والدكتور اويلينا Sokołowska على مساعدتها ومشاركتها في الأعمال على المخطوطة الأصلية، وإلى Jasińska ويرونيكا لتقديم الدعم التقني.
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
MTBE | Biosolve | 138906 | |
Methanol | Biosolve | 136806 | |
Water | Biosolve | 232106 | |
Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
Formic acid | Biosolve | 69141 | |
Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
MaxQuant | NaN | NaN |