אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-מטבוליט מכריעים עבור כל פונקציות הסלולר. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח מקביל של אינטראקציות אלה עם חלבון של בחירה. פרוטוקול שלנו היה אופטימיזציה עבור הצמח תרביות תאים, והוא משלב טיהור זיקה עם חלבון מבוסס ספקטרומטר מסה וזיהוי מטבוליט.
תהליכים תאיים מוסדרים על ידי אינטראקציות בין מולקולות ביולוגיות כגון חלבונים, מטבוליטים ו חומצות גרעין. אמנם אין חידוש החקירה של אינטראקציות חלבון (PPI), גישות ניסיוניות מכוון לאפיון אינטראקציות חלבון-מטבוליט אנדוגני (PMI) מהווים התפתחות למדי. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר אפיון סימולטני של PPI, PMI של חלבון של בחירה, המכונה פיתיון. פרוטוקול שלנו היה מותאם עבור תא תודרנית תרבויות, והוא משלב זיקה טיהור (AP) עם ספקטרומטר מסה (MS)-המבוסס על זיהוי חלבונים, מטבוליט. בקיצור, קווים תודרנית מהונדס, המבטאים חלבונים פיתיון דבוקה תג קירבה, הם קודם lysed להשיג תמצית הסלולר מקורית. נוגדנים אנטי-תג משמשים כדי להוריד את השותפים חלבון ו מטבוליט של החלבון פיתיון. מתחמי מטוהרים זיקה מופקים באמצעות מתיל טרטצעד אחד-בוטיל אתר (MTBE) / מתנול/מים בשיטה. בעוד מטבוליטים להפריד את קוטבי או השלב הידרופוביות, ניתן למצוא חלבונים בגדר. מטבוליטים והן חלבונים מכן נותחו על ידי אולטרה-ביצועים נוזלי כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (UPLC-MS או UPLC-MS/MS). ריק-וקטור (EV) בקרת קווי משמשים כדי לא לכלול תוצאות חיוביות שגויות. היתרון העיקרי של פרוטוקול שלנו הוא שהם מאפשרים זיהוי של שותפים חלבון ו מטבוליט של חלבון המטרה במקביל בתנאים ליד-פיזיולוגיים (סלולריים lysate). השיטה הציג היא פשוטה, מהירה, ניתן להתאים בקלות למערכות ביולוגיות חוץ תרביות תאים הצמח.
השיטה המתוארים כאן מטרות על הזיהוי של המטבוליט וחלבון השותפים של חלבון של בחירה בתנאים lysate הסלולר ליד –ב- vivo . זה כבר העריכו שיש רבים מטבוליטים יותר מאשר מאופיין היום של פונקציית רגולציה חשוב1. מטבוליטים יכול לשמש מתגים ביולוגי, לשנות את הפעילות, פונקציונליות, ו/או לוקליזציה של שלהם קולטן חלבונים2,3,4. בעשור האחרון מספר שיטות פריצת דרך, המאפשרת זיהוי של PMI ויוו או בתנאים ליד –ב- vivo , כבר מפותחת5. גישות זמין ניתן להפריד לשתי קבוצות. הקבוצה הראשונה כוללת טכניקות להתחיל עם פיתיון ידוע-מטבוליט על מנת ללכוד חלבון הרומן שותפים. שיטות כוללות זיקה כרומטוגרפיה6, סמים זיקה היעד מגיב-יציבות assay7, כימותרפיה-פרוטאומיקס8ו פרוטאום תרמית פרופיל9. הקבוצה השנייה מורכבת שיטה אחת שמתחילה חלבון ידוע על מנת לזהות מולקולה קטנה ליגנדים10,11.
AP בשילוב עם lipidomics מבוססי MS שימש כדי לנתח חלבון-השומנים מתחמי האפייה12. כנקודת התחלה, המחברים השתמשו זני שמרים לבטא 21 אנזימים המעורבים ביוסינטזה ergosterol, 103 kinases דבוקה הוא לטיהור טנדם-זיקה (ברז) תג. 70% של האנזימים ו-20% kinases נמצאו לאגד ליגנדים הידרופובי שונים, ושופך אור לתוך הרשת אינטראקציית חלבון מורכב-השומנים.
בעבר, יכולתי נדגים, באופן דומה כדי שומנים, תרכובת פולאר polar למחצה גם להישאר מאוגד ל קומפלקסי חלבון מבודד lysates הסלולרית13. על סמך ממצאים אלה, החלטנו למטב את AP שיטת שפורסם בעבר10,11 תאי צמחים, תרכובות הידרופילית14. למטרה זו, השתמשנו ברז וקטורים, מתוארת על ידי ואן Leene. ואח 2010, משתמשים בהצלחה במפעל PPI מחקרים15. כדי לקצר את משך הזמן הנדרש להשגת שורות מהונדס, החלטנו על תרביות תאים תודרנית. אנחנו מועסקים מתיל טרטצעד אחד-בוטיל אתר, (MTBE) / מתנול/מים החילוץ שיטה, המאפשר אפיון חלבונים (גלולה), ליפידים (שלב אורגני) ו הידרופילית מטבוליטים (פאזה מימית)16 יחיד זיקה-טיהור הניסוי. EV בקרת קווי הוכנסו כדי לא לכלול תוצאות חיוביות שגויות, כגון חלבונים מחייב את התג לבד. כמו הוכחת לנו מתויגות שלוש (מתוך חמש) nucleoside diphosphate kinases להציג הגנום תודרנית (NDPK1-NDPK3). בין השאר, אנחנו יכול להדגים כי NDPK1 אינטראקציה עם גלוטתיון S-טרנספראז גלוטטיון. כתוצאה מכך נוכל להוכיח כי NDPK1 הוא נתון glutathionylation14.
לסיכום, פרוטוקול הציג היא כלי חשוב עבור אפיון חלבון ורשתות אינטראקציית חלבון-מולקולה קטנה ומהווה התקדמות גדולה על פני שיטות קיימות.
פרוטוקול הציג מאפשר זיהוי מקבילי של מתחמי PP ו- PM של חלבון המטרה. מ שיבוט על התוצאות הסופיות, ניתן להשלים את הניסוי קצת כמו 8-12 שבועות. AP מלאה אורכת כ 4-6 h עבור קבוצה של 12 עד 24 דגימות, עיבוד פרוטוקול שלנו מתאימים לניתוח תפוקה באמצע.
הפרוטוקול, למרות להיות בסך הכל פשוטה, יש מספר שלבים קריטיים. (i) כמות מספקת של חלבון קלט וחרוזים זיקה חיוני להגיע טווח דינמי של המטבוליט זיהוי. פירוק התא יעיל לכן צעד מכריע בהליך. התשואות המסכן חלבון יכול להיות תוצאה של pulverization לא מספקת של החומר או של שיוצרת יחס פירוק-מאגר/חומר. (ii) להקפיד כי ריאגנטים בשימוש הם ידידותיים MS. חומרי ניקוי חזקים, גליצרול או כמויות מוגזמות של מלח יש להימנע ככל מתערבות MS זיהוי. (iii) חרוזים Agarose לא צריך להיות יבשים יתר במהלך שטיפת שלבים, כאשר משתמש של יריעה ואקום זה חשוב להחיל קצב זרימה איטית כדי לא כדי להרוס את החרוזים או להשפיע על יציבות מורכבים.
ישנם כמה שינויים אפשריים חשובים בפרוטוקול הציג: (i) נשתמש האמרגן CaMV35S המכונן כדי למקסם את כמות החלבון פיתיון. ביטוי, בעוד מאוד שימושי, ניתן להיות השפעה רצינית על הומאוסטזיס תא28 , להוביל להיווצרות אינטראקציות לא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. ביטוי של חלבונים מתויגים באמצעות היזמים מקורי שבו האפשר רקע אובדן-של-פונקציה נחשב נעלה לאחזור interactors הביולוגית האמיתית. חלבונים בדרך כלל לא באה לידי ביטוי בתרבויות תא צמח, צמח רקע יוכיח הדרושות כדי לזהות interactors רלוונטיים. (ii) בעת עבודה עם קרום חלבונים, המאגר פירוק צריך להיות בתוספת של דטרגנט התואמים ל- MS. (iii) הקדמה של שלב טיהור זיקה שני יכול לשפר שווא-תוצאות חיוביות ליחס חיובי true, לבטל את הצורך פקדים EV29. תג טנדם הרומן עם שני אתרים פרוטאז עצמאית-המחשוף מציג חלופה אטרקטיבית השלב גודל-הדרה כרומטוגרפיה שנוספו על-ידי. et al. 2014 מיאדה11, זה מפרך וגם זמן רב.
החיסרון החמורה ביותר של נקודת הגישה הוא שיעור גבוה של תוצאות חיוביות שגויות. הסיבות הן רבות. ביטוי מכוננת כבר הוזכר. מקור נוסף של אינטראקציות לא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, אלא אם כן עובד עם organelles מבודד, הוא הכנת כל-תא lysates המכיל תערובת של חלבונים ושל מטבוליטים של תאים subcellular שונים. לוקליזציה subcellular אמור לשמש כדי לבצע סינון עבור interactors אמיתי. ובכל זאת, הרוב המכריע של תוצאות חיוביות שגויות כתוצאה איגוד לא ספציפי בין חלבונים שרפים agarose. הקדמה של שלב טיהור שני, כפי שתוארה לעיל, מציעה את הפתרון הטוב ביותר לבעיה, עם זאת מגיע על חשבון זמן ותפוקת. יתר על כן, אינטראקציה חלשה עלול ללכת לאיבוד כמו הפרוטוקול מתארך. אזהרה נוספת של AP הוא למרות מידע מקיף שמספק לגבי interactome של חלבון המטרה, המבדילים בין היעדים הישירים והעקיפים של החלבון פתיונים הוא בלתי אפשרי. גישות ריאקציה דו-מולקולרית יישוב נדרשים לאשר אינטראקציות.
AP בשילוב עם גליקומיקס מבוססי MS שימש ללמוד חלבון-מתחמי cerevisiae ס12. עבודה זו, יחד עם שלנו תצפית קודמות13 , באופן דומה כדי שומנים, תרכובת פולאר polar למחצה להישאר מאוגד ל קומפלקסי חלבון מבודד תאית lysates, סיפק והיערכות מושגית עבור פרוטוקול שהוצגו. פרוטוקול שלנו מאופיין על ידי שלוש נקודות ייחודיות: (i) לעומת זאת כדי השמרים לעבוד12, הוא מדגים כי AP מתאים מאחזר לא רק חלבון הידרופובי אבל גם הידרופילית ליגנדים. (ii) בהצגת נוהל חילוץ 3-in-one, AP יחיד ניתן ללמוד interactors חלבון ו מטבוליט של החלבון פיתיון. (iii). שינינו את פרוטוקול לשתול תאים.
המאמצים העתידיים יתמקד ביצירת תג טנדם הרומן עם שני אתרים פרוטאז עצמאית-המחשוף. אנחנו רוצים גם לחקור את התאמתו של הפרוטוקול כדי נמוך-שפע מולקולות קטנות כמו הורמונים צמחיים.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות בחביבות פרופ ‘ ד ר לותאר Willmitzer בשל מעורבותו בפרוייקט, בדיונים פרודוקטיביים ולאחר השגחה מעולה. אנחנו אסירי תודה ד ר דניאל Veyel שעזרת עם מדידות MS פרוטיאומיה מבנית. אנחנו מעריכים מיכאליס Änne גברת מי סיפק לנו עזרה טכנית שלא תסולא בפז מדידות LC-MS. יתר על כן, ברצוננו להודות ד ר מוניקה Kosmacz, ד ר Ewelina Sokołowska שלהם לעזרה ומעורבות בעבודה על כתב היד המקורי, ולא כדי Weronika Jasińska לקבלת תמיכה טכנית.
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
MTBE | Biosolve | 138906 | |
Methanol | Biosolve | 136806 | |
Water | Biosolve | 232106 | |
Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
Formic acid | Biosolve | 69141 | |
Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
MaxQuant | NaN | NaN |