Взаимодействий протеин протеина и белка метаболит имеют решающее значение для всех клеточных функций. Здесь мы описываем протокол, который позволяет параллельный анализ этих взаимодействий с белка выбора. Наш протокол был оптимизирован для культур клеток растений и сочетает в себе очищение сродства с массы на основе спектрометрии белков и метаболитов обнаружения.
Клеточные процессы регулируются взаимодействия биологических молекул, таких как белки, метаболитов и нуклеиновых кислот. Хотя расследование белок белковых взаимодействий (PPI) не новинка, экспериментальные подходы, стремясь охарактеризовать эндогенного белка метаболит взаимодействий (PMI) составляют довольно недавно. Здесь мы представляем протокол, который позволяет одновременное характеристика ИЦП и PMI белка выбора, именуемые как приманку. Наш протокол был оптимизирован для клеток Arabidopsis культур и сочетает в себе очищение сродства (AP) с масс-спектрометрия (МС)-на основе обнаружения белков и метаболитов. Короче говоря трансгенных линий Arabidopsis, выражая приманки белка, сливается в тег сходства, сначала лизированы получить собственный сотовый экстракт. Анти тег антитела используются для тянуть вниз белков и метаболитов партнеров приманки белка. Близость очищенная комплексы извлекаются с помощью одношагового метил трет-бутилового эфира (МТБЭ) / метанол/воды методом. Хотя метаболитов разделить на полярных или этапа гидрофобная, белки можно найти в гранулы. Метаболиты и белки затем анализируются ультра производительность жидкого хроматография масс-спектрометрия (МС-UPLC или UPLC-МС/МС). Пустой вектор (EV) управления линии используются для исключения ложных срабатываний. Основное преимущество нашего протокола является, что он позволяет идентификации белков и метаболитов партнеров целевого белка параллельно в рядом физиологических условиях (сотовых lysate). Представленный метод простой, быстрый и может быть легко адаптирована для биологических систем, отличных от культуры клеток растений.
Метод здесь описано направлена на выявление партнеров метаболит и белка белка выбора в ближайшем –в vivo сотовой lysate условиях. Было предположение, что многие другие метаболиты чем характеризуется сегодня имеют важные нормативные функции1. Метаболиты могут действовать как биологические коммутаторы, изменяя активность, функциональность, и/или локализации их рецептор белков2,и3,4. В последнее десятилетие несколько прорыв методы, позволяя идентификации PMI в естественных условиях или в условиях Ближнего –в vivo , были развитые5. Доступные подходы могут быть разделены на две группы. Первая группа включает в себя методы, которые начинаются с известный метаболит приманку для улавливания романный протеин партнеров. Методы включают хромотографии сродства6, наркотиков близость реагировать целевой стабильность пробирного7, химио протеомики8и тепловых профилирование9протеома. Вторая группа состоит из одного метода, который начинается с известного белка для выявления мелкомолекулярных лигандов10,11.
AP, в сочетании с на основе MS lipidomics использовался для анализа белково липидные комплексов в Saccharomyces cerevisiae12. Как отправной точки авторы использовали штаммы дрожжей, выражая 21 ферментов, участвующих в биосинтезе эргостерол и 103 киназы сливается с тандем сродства очищения (TAP) тег. 70% ферментов и 20% киназ были найдены для привязки различных гидрофобные лигандов, проливая свет в сложный белково липидные сеть взаимодействия.
Ранее мы смогли продемонстрировать, что, аналогично в липиды, полярных и полу полярных соединений также оставаться связанными белковых комплексов, изолированных от сотовой лизатов13. Основываясь на этих выводах, мы решили оптимизировать AP метод ранее опубликованы11 10,растительных клеток и гидрофильные соединения14. Для этой цели мы использовали TAP векторов, описываемого Van Leene et al. 2010, успешно используется в завод PPI исследования15. Чтобы сократить время, необходимое для получения трансгенных линий, мы решили на культурах клеток арабидопсиса. Мы заняты одношаговый метил трет-бутиловый эфир, (МТБЭ) / метанол/вода извлечения метода, позволяя характеристика белков (гранулы), липиды (органические фазы) и гидрофильные метаболитов (водная фаза)16 в одном очищение сродства эксперимент. EV линии контроля были введены для исключения ложных срабатываний, например привязка к тегу только белки. Как доказательство концепции, мы с тегами три (из пяти) нуклеозидов дифосфат киназы присутствует в геном арабидопсиса (NDPK1-NDPK3). Среди других выводов, мы смогли продемонстрировать, что NDPK1 взаимодействует с глутатион S-трансферазы и глутатиона. Поэтому мы смогли доказать, что NDPK1 подвергается glutathionylation14.
Короче говоря, представленный протокол является важным инструментом для характеризующие протеин протеина и белка мелкомолекулярных взаимодействия сетей и представляет собой крупный шаг вперед над существующими методами.
Представленные протокол позволяет параллельно идентификации PP и вечера комплексов целевого белка. От клонирования на окончательные результаты, эксперимент может быть завершена в качестве лишь 8-12 недель. Полная AP занимает около 4-6 ч для набора образцов 12-24, рендеринга нашей протокол для анализа средней пропускной способности.
Протокол, несмотря на в целом проста, имеет ряд важных шагов. (i) достаточное количество входных белка и близость бусины имеет решающее значение для достижения динамического диапазона обнаружения метаболит. Лизис эффективный клетки таким образом представляет собой решающий шаг в процедуре. Бедных белками урожайность может быть следствием недостаточной пульверизация материала или коэффициента субоптимальные лизис буфера/материал. (ii) следует позаботиться что используемые реагенты являются MS-чистые. Сильные моющие средства, глицерин или чрезмерного количества соли следует избегать, поскольку они мешают MS обнаружения. (iii) агарозы бусины не должно быть чрезмерно сухой во время стирки шаги, и при использовании вакуумного коллектора важно применять медленным потоком скоростью, так как не уничтожить бусы или повлиять на стабильность работы комплекса.
Есть некоторые важные возможные изменения, представленные протокол: (i) мы используем учредительного CaMV35S промоутер для максимального количества белка приманки. Гиперэкспрессия, в то время, как это очень полезно, может иметь серьезное воздействие на клетки гомеостаза28 и привести к образованию физиологически нерелевантных взаимодействий. Выражение тегами белков, с использованием собственных промоутеров и где возможно на фоне потери функции считается выше для получения истинной биологических посредники. Для белки, обычно не выражены в культуры клеток растений завод фона может оказаться необходимым определить соответствующие посредники. (ii) при работе с мембранных белков, литического буфера должна дополняться с MS-совместимых моющего средства. (iii) введение второй шаг очищение сродства может улучшить ложных срабатываний true срабатываний соотношение и устраняют необходимость управления EV29. Роман тандем тег с двумя независимыми протеаз расщепление сайтов представляет собой привлекательную альтернативу для размера-гель-проникающей хроматографии шаг добавил Маэда et al. 201411, который является трудоемким и требует много времени.
Наиболее серьезным недостатком AP является высокий уровень ложных срабатываний. Причины многочисленны. Учредительный гиперэкспрессия уже упоминалось. Еще одним источником физиологически нерелевантных взаимодействий, если работать с изолированной органеллы, является подготовка всего-lysates клетки содержащие смеси белков и метаболитов из различных внутриклеточных отсеков. Субцеллюлярные локализации должны использоваться для фильтрации для истинной посредники. Тем не менее большинство ложных срабатываний следствием неспецифической привязку между белками и агарозы смол. Введение второго шага очистки, как описано выше, предлагает лучшее решение для этой проблемы, однако, достигается за счет времени и пропускной способности. Кроме того слабые взаимодействия могут быть потеряны, поскольку протокол удлиняет. Еще один нюанс AP является то, что несмотря на всеобъемлющую информацию, которую он предоставляет о interactome целевого белка, различия между прямым и косвенным целями наживкой белка невозможно. Целевые bimolecular подходы необходимы для подтверждения взаимодействий.
AP, в сочетании с на основе MS метаболомики был использован для изучения белков комплексы в S. cerevisiae12. Эта работа, наряду с нашей ранее наблюдения13 , что аналогично в липиды, полярных и полу полярных соединений оставаться связанными белковых комплексов, изолированных от сотовой лизатов, предоставляет концептуальную основу представленные протокол. Наш протокол характеризуется три уникальных точек: (i) в отличие от дрожжей работают12, он демонстрирует, что AP подходит для извлечения не только гидрофобным но также гидрофильные белки лигандами. (ii) путем введения протокол извлечения три в одном, один AP может использоваться для изучения белков и метаболитов посредники приманки белка. (iii) мы адаптировали протокол к заводе клетки.
Будущие усилия будут сосредоточены на создание тега Роман тандем с двумя независимыми протеаз расщепление сайтов. Мы также хотели бы изучить пригодность протокола к низкой обилие небольших молекул, таких как растительные гормоны.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы заранее признать профессор доктор Лотар Willmitzer за его участие в проекте, продуктивные дискуссии и большой надзор. Мы благодарны д-р Даниэль Veyel за помощь с proteomic MS измерений. Мы ценим миссис Änne Михаила, который предоставил нам неоценимую техническую помощь с измерениями LC-MS. Кроме того мы хотели бы поблагодарить д-р Моника Kosmacz и доктор Эвелина Sokołowska за их помощь и участие в работе на оригинальной рукописи и Вероника Jasińska для технической поддержки.
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
MTBE | Biosolve | 138906 | |
Methanol | Biosolve | 136806 | |
Water | Biosolve | 232106 | |
Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
Formic acid | Biosolve | 69141 | |
Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
MaxQuant | NaN | NaN |