단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.
세포질 과정은 단백질, 대사, 핵 산 등과 같은 생체 분자 간의 상호 작용에 의해 통제 된다. 단백질 단백질 상호 작용 (PPI)의 조사는 없는 참신, 실험적인 접근 생 단백질 대사 산물 상호 작용 (PMI)을 특성화 목표로 오히려 최근 개발을 구성 합니다. 여기, 우리는 PPI와 미끼 라고 선택의 단백질의 PMI의 동시 분석을 허용 하는 프로토콜을 제시. 우리의 프로토콜은 최적화 된 애기 셀 문화 및 친 화력 정화 (AP)를 결합 한 질량 분석 (MS)와 함께-기반 단백질 및 대사 산물 검출. 즉, 미끼 단백질 선호도 태그 융합을 표현 하는 유전자 변형 애기 라인 기본 세포 추출을 lysed 처음은. 방지 태그 항 체는 풀 미끼 단백질의 단백질 및 대사 산물 파트너 다운 하는 데 사용 됩니다. 친 화력 정화 단지 1 단계 메 틸 tert를 사용 하 여 추출 됩니다-부 틸 에테르 (티비) / 메탄올/물 방법. 대사는 극 지 또는 소수 성 위상, 분리 하는 동안 단백질 펠 릿에서 찾을 수 있습니다. 대사 산물과 단백질 다음 울트라 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (UPLC MS 또는 UPLC-MS/MS)에 의해 분석 된다. 빈 벡터 (EV) 제어 라인 가양성을 제외 하는 데 사용 됩니다. 우리의 프로토콜의 주요 장점은 근처 생리 적 조건 (세포 lysate)에서 동시에 대상 단백질의 단백질 및 대사 산물 파트너의 식별 수 있습니다. 제시 방법 간단, 신속, 그리고 식물 세포 배양 이외의 생물 학적 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다.
방법을 설명 여기 근처-vivo에서 세포 lysate 조건에서 선택의 단백질의 대사 산물과 단백질 파트너의 식별에 목표. 그것은 많은 더 많은 대사 산물 오늘 특징 보다는 중요 한 규제 기능1는 추측 하고있다. 대사 산물은 생물학 스위치, 활동, 기능, 및 그들의 수용 체 단백질의2,,34의 지역화 변경으로 작동할 수 있다. 지난 10 년간에서 근처-vivo 조건, 또는 vivo에서 PMI의 식별 사용 여러 가지 획기적인 방법이 개발된5되었습니다. 사용할 수 있는 접근은 두 그룹으로 분리 수 있습니다. 첫 번째 그룹에는 소설 단백질 파트너를 트랩 하려면 알려진 대사 산물 미끼와 함께 시작 하는 기술 구성 되어 있습니다. 방법은 선호도 크로마토그래피6, 마약 선호도 응답 대상-안정성 분석 결과7, 항 암 치료-proteomics8및9프로 파일링 열 프로테옴 포함 됩니다. 알려진된 단백질 작은 분자 ligands10,11을 식별 하기 위해 시작 하는 단일 메서드 두 번째 그룹에 의하여 이루어져 있다.
MS 기반 lipidomics 함께 AP Saccharomyces cerevisiae12. 단백질 지질 단지 분석 하는 데 사용 했다 시작 지점으로 저자 표현 21 효소 ergosterol 생 합성에 관여 하는 효 모 종자를 사용 하 고 103 kinases 융합 협동 친 화력 정화 (꼭지) 태그. 효소의 70% 및 20%는 kinases의 복잡 한 단백질 지질 상호 작용 네트워크로 빛을 발산 하는 다른 소수 성 ligands를 바인딩할 발견 됐다.
이전에, 마찬가지로 지질, 극 지와 반 극 지 화합물 또한 유지 세포 lysates13에서 고립 된 단백질 복합물에 바인딩된 수 설명 합니다. 이러한 결과에 따라, 우리는 AP를 최적화 하기로 메서드 출판 이전 식물 세포 및 친수성 화합물1410,11 . 이 목적으로, 밴 Leene 외. 2010, PPI 연구15공장에서 성공적으로 사용 하 여 설명 탭 벡터 사용 했습니다. 유전자 변형 라인을 얻는 데 필요한 시간을 단축, 우리 애기 세포 배양에 결정 했다. 우리 고용 원스텝 메 틸 tert-부 틸 에테르, (티비) / 메탄올/물 추출 방법, 단일에서 단백질 (펠 릿), 지질 (유기 단계), 그리고 친수성 대사 (수성 단계)16 의 특성을 허용 친 화력 정화 실험입니다. EV 컨트롤 라인 가양성, 혼자 태그에 바인딩 단백질 예 제외에 도입 되었다. 우리는 3 (5) 태그 개념의 증거로 서 nucleoside diphosphate kinases 애기 게놈 (NDPK1-NDPK3)에 존재. NDPK1 티 S상호 작용 설명 수 다른 결과, 중-전이 효소와 티. 따라서 우리는 NDPK1 glutathionylation14받게 됩니다 증명할 수 있습니다.
정리해 보면, 제시 프로토콜 단백질-단백질 및 단백질 작은 분자 상호 작용 네트워크 특성화를 위한 중요 한 도구 이며 기존 방법에 비해 주요 사전 구성.
제시 프로토콜 대상 단백질의 PP와 오후 단지의 병렬 식별 수 있습니다. 최종 결과를 복제에서 실험 8-12 주 만큼 적게 완료할 수 있습니다. 완전 한 AP 걸립니다 약 4-6 h 12 ~ 24 샘플 집합에 대 한 우리의 프로토콜 중간 처리량 분석을 위한 적합 한 렌더링.
프로토콜, 되 고 전반적으로 간단에 불구 하 고 중요 한 단계의 수가 있다. (i) 충분 한 양의 입력된 단백질 및 선호도 구슬 대사 산물 탐지의 동적 범위를 도달 하는 중요 한 이다. 효율적인 셀 세포 따라서 절차에서 중요 한 단계입니다. 불 쌍 한 단백질 수율 차선 세포의 용 해 버퍼/재료 비율 또는 자료의 부족 분쇄의 결과 될 수 있습니다. (ii) 해야 주의 사용된 시 약 MS-친화입니다. 강한 세제, 글리세롤, 또는 소금의 과도 한 양의 그들은 MS 검색을 방해 피해 야 한다. (iii) Agarose 구슬 해서는 안됩니다-건조 단계, 세척 하는 동안 그리고 진공 매니폴드를 사용 하는 경우 그것은 구슬 파괴 또는 복잡 한 안정성에 영향을 미칠에 그렇게 하지 않도록 느린 흐름 속도 적용 하는 것이 중요.
제시 프로토콜에 중요 한 몇 가지 가능한 수정이 있다: (i) 제정 CaMV35S 모터를 사용 하 여 미끼 단백질의 양을 최대화 하는 우리. Overexpression, 매우 유용한, 고 수 있습니다 세포 항상성28 에 심각한 영향을 미칠 생리 적으로 관련이 없는 상호 작용의 형성으로 이어질. 식 사용 하 여 네이티브 발기인 기능 손실 배경에서 가능한 진정한 생물학 인터 검색에 대 한 우수한 여겨진다 태그 단백질입니다. 일반적으로 식물 세포 배양에 표현 하는 단백질에 대 한 식물 배경 관련 인터를 식별 하는 데 필요한 증명할 수 있습니다. (ii) 작업할 때 막 단백질, 세포의 용 해 버퍼는 MS 호환 세제로 보완 될 필요가 있다. (iii) 두 번째 친 화력 정화 단계 소개 가양성 true 반응 비율을 개선 하 고 EV 컨트롤29필요 수 있습니다. 두 개의 독립적인 효소 분열 사이트 소설 탠덤 태그 모두 힘들고 시간이 소모 되는 마에 다 외. 201411, 추가 크기 배제 크로마토그래피 단계에 매력적인 대안을 선물 한다.
AP의 가장 심각한 결점은 잘못 된 반응의 높은 속도. 이유는 수많은. 제정 overexpression 이미 언급 했다. 순수 없는 상호 작용의 다른 소스 고립 된 세포를 사용 하지 않는 한 단백질과 다른 subcellular 구획에서 대사 산물의 혼합물을 포함 하는 전체 세포 lysates의 준비 이다. Subcellular 지 방화는 진정한 인터에 대 한 필터링을 사용 해야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 잘못 된 반응의 대부분 난다 바인딩 단백질과 agarose 수 지 사이에서 유래한 다. 그러나 두 번째 정화 단계의 소개, 위에서 설명한 문제에 최고의 솔루션을 제공 합니다, 그리고 시간과 처리량 비용 온다. 또한, 약한 상호 작용 프로토콜 확장으로 손실 될 수 있습니다. AP의 또 다른 경고는 포괄적인 정보 제공 하는 위하여 대상 단백질의,에 불구 하 고 baited 단백질의 직접 및 간접 목표 구별 불가능 이다. 타겟된 분자 접근 상호 작용을 확인 필요 합니다.
MS 기반 대사체학 함께 AP S. cerevisiae12. 단백질 복합물 공부 하는 사용 했다 이 작품은, 마찬가지로 지질, 극 지와 반 극 지 화합물 유지 세포 lysates에서 고립 된 단백질 복합물에 바인딩된 우리의 이전 관찰13 함께 제시 프로토콜에 대 한 개념적 기초를 제공 합니다. 우리의 프로토콜 3 독특한 포인트 특징 이다: (i) 반면에 누 룩을 작동12, AP 검색 뿐만 아니라 소수 하지만 또한 친수성 단백질 ligands에 적합 하다는 설명. (2) 3-에서-하나의 추출 프로토콜을 도입 하 여 미끼 단백질의 단백질 및 대사 산물 인터를 공부 하는 단일 AP은 사용할 수 있습니다. (iii) 우리는 식물 세포 프로토콜을 적응.
향후 두 개의 독립적인 효소 분열 사이트 소설 탠덤 태그를 만드는 방법에 집중할 것 이다. 우리 또한 낮은 풍부한 식물 호르몬과 같은 작은 분자에 프로토콜의 적합성을 탐험 하 고 싶습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 친절 하 게 그의 참여 프로젝트, 생산적인 토론과 좋은 감독에 대 한 교수 박사 로타어 Willmitzer를 인정 하 고 싶습니다. 우리는 proteomic MS 측정 도움 박사 다니엘 Veyel에 감사입니다. 우리 부인 Änne Michaelis LC MS 측정 우리 귀중 한 기술적인 도움을 제공 주셔서 감사 합니다. 또한, 우리는 닥터 모니카 Kosmacz와 박사 Ewelina Sokołowska Weronika Jasińska를 그들의 도움과 원래 원고에서 작업에 참여에 대 한 기술 지원을 감사 하 고 싶습니다.
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
MTBE | Biosolve | 138906 | |
Methanol | Biosolve | 136806 | |
Water | Biosolve | 232106 | |
Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
Formic acid | Biosolve | 69141 | |
Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
MaxQuant | NaN | NaN |