प्रोटीन प्रोटीन और प्रोटीन metabolite बातचीत सभी सेलुलर कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस के साथ साथ, हम एक प्रोटोकॉल है कि पसंद की एक प्रोटीन के साथ इन बातचीत के समानांतर विश्लेषण की अनुमति देता है का वर्णन । हमारे प्रोटोकॉल संयंत्र सेल संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया था और जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटीन और metabolite का पता लगाने के साथ समानता शुद्धि को जोड़ती है ।
सेलुलर प्रक्रियाओं ऐसे प्रोटीन, चयापचयों, और न्यूक्लिक एसिड के रूप में जैविक अणुओं के बीच बातचीत द्वारा विनियमित रहे हैं । हालांकि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) की जांच कोई नवीनता नहीं है, अंतर्जात प्रोटीन-metabolite इंटरैक्शन (पीएमआई) को चिह्नित करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का गठन एक जगह हाल ही में विकास है । इस के साथ साथ, हम एक प्रोटोकॉल है कि पीपीआई और पसंद की एक प्रोटीन के पीएमआई के एक साथ लक्षण वर्णन, चारा के रूप में निर्दिष्ट की अनुमति देता है वर्तमान । हमारे प्रोटोकॉल Arabidopsis सेल संस्कृतियों के लिए अनुकूलित और जन स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ समानता शुद्धि (एपी) को जोड़ती है-प्रोटीन और metabolite का पता लगाने आधारित है । संक्षेप में, ट्रांसजेनिक Arabidopsis लाइनों, एक समानता टैग करने के लिए जुड़े चारा प्रोटीन व्यक्त, पहली लीजड ड एक देशी सेलुलर निकालने प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं । विरोधी टैग एंटीबॉडी को नीचे प्रोटीन और चारा प्रोटीन के metabolite भागीदारों खींचने के लिए उपयोग किया जाता है । संबध-शुद्धि परिसरों एक एक कदम मिथाइल tert-butyl ईथर (MTBE)/methanol/water विधि का उपयोग कर निकाले जाते हैं । Whilst चयापचयों या तो ध्रुवीय या hydrophobic चरण में अलग, प्रोटीन गोली में पाया जा सकता है । दोनों चयापचयों और प्रोटीन तो अल्ट्रा प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण कर रहे है (UPLC-ms या UPLC-ms/ खाली वेक्टर (EV) नियंत्रण लाइनों झूठी सकारात्मक बाहर करने के लिए उपयोग किया जाता है । हमारे प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ यह है कि यह प्रोटीन और निकट शारीरिक स्थितियों (सेलुलर lysate) में समानांतर में एक लक्ष्य प्रोटीन की metabolite भागीदारों की पहचान में सक्षम बनाता है । प्रस्तुत विधि सीधा है, जल्दी है, और आसानी से जैविक संयंत्र सेल संस्कृतियों के अलावा अंय प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
यहां वर्णित विधि के पास मेंvivo सेलुलर lysate शर्तों में पसंद की एक प्रोटीन की metabolite और प्रोटीन भागीदारों की पहचान करने के लिए करना है । यह अटकलें लगाई गई है कि आज की तुलना में कई और अधिक चयापचयों एक महत्वपूर्ण विनियामक समारोह1है । चयापचयों जैविक स्विच के रूप में कार्य कर सकते हैं, गतिविधि, कार्यक्षमता को बदलने, और/या उनके रिसेप्टर प्रोटीन के स्थानीयकरण2,3,4. पिछले दशक में कई सफलता के तरीके, vivo में या निकट मेंvivo स्थितियों में पीएमआई की पहचान को सक्षम करने,5विकसित किया गया है । उपलब्ध दृष्टिकोण दो समूहों में अलग किया जा सकता है । पहले समूह तकनीक है कि एक ज्ञात metabolite चारा के साथ शुरू करने के लिए जाल उपंयास प्रोटीन भागीदारों में शामिल हैं । तरीकों संबध क्रोमैटोग्राफी6, दवा संबध उत्तरदायी लक्ष्य-स्थिरता परख7, chemo-प्रोटियोमिक्8, और थर्मल proteome9profiling शामिल हैं । दूसरे समूह के एक एकल तरीका है कि एक ज्ञात प्रोटीन के साथ शुरू होता है क्रम में छोटे अणु लाइगैंडों10,11की पहचान के होते हैं ।
एपी एमएस आधारित lipidomics के साथ मिलकर Saccharomyces cerevisiae12में प्रोटीन लिपिड परिसरों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, लेखक खमीर ergosterol में शामिल 21 एंजाइमों व्यक्त उपभेदों का इस्तेमाल किया और १०३ kinases एक मिलकर-संबध शुद्धि (नल) टैग से जुड़े । एंजाइमों और kinases के 20% के ७०% विभिंन hydrophobic लाइगैंडों बांध पाया गया, जटिल प्रोटीन लिपिड संपर्क नेटवर्क में प्रकाश बहा ।
पहले, हम प्रदर्शित कर सकते है कि, इसी तरह लिपिड, ध्रुवीय और अर्द्ध ध्रुवीय यौगिकों भी प्रोटीन lysates13से पृथक परिसरों के लिए बाध्य रहना । इन निष्कर्षों के आधार पर, हम पहले10,संयंत्र कोशिकाओं और हाइड्रोफिलिक यौगिकों14के लिए11 प्रकाशित एपी विधि को अनुकूलित करने का फैसला किया । इस प्रयोजन के लिए, हम वान Leene एट अल. २०१० द्वारा वर्णित नल वैक्टर इस्तेमाल किया, सफलतापूर्वक संयंत्र पीपीआई अध्ययन15में इस्तेमाल किया । ट्रांसजेनिक लाइनों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय को छोटा करने के लिए, हम Arabidopsis सेल संस्कृतियों पर फैसला किया । हम एक एक कदम मिथाइल tert-butyl ईथर कार्यरत हैं, (MTBE)/methanol/water निष्कर्षण विधि, प्रोटीन (गोली), लिपिड (कार्बनिक चरण), और हाइड्रोफिलिक चयापचयों (जलीय चरण) के लक्षण वर्णन की अनुमति एक एकल में16 अपनत्व-शुद्धि प्रयोग. EV नियंत्रण लाइनें झूठी सकारात्मक बाहर करने के लिए पेश किया गया, जैसे अकेले टैग करने के लिए बाध्यकारी प्रोटीन । अवधारणा के सबूत के रूप में हम तीन टैग (पांच के) nucleoside diphosphate Arabidopsis जीनोम (NDPK1-NDPK3) में मौजूद kinases । अंय निष्कर्षों के अलावा, हम प्रदर्शन कर सकते है कि NDPK1 glutathione एसके साथ बातचीत-ट्रांस्फ़्रेज़ और glutathione । नतीजतन हम साबित कर सकते है कि NDPK114glutathionylation के अधीन है ।
योग करने के लिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल निस्र्पक प्रोटीन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है प्रोटीन और प्रोटीन छोटे अणु संपर्क नेटवर्क और मौजूदा तरीकों पर एक प्रमुख अग्रिम का गठन किया ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल पीपी और प्रधानमंत्री एक लक्ष्य प्रोटीन के परिसरों की समानांतर पहचान की अनुमति देता है । क्लोनिंग से अंतिम परिणाम के लिए, प्रयोग के रूप में छोटे रूप में 8-12 सप्ताह में पूरा किया जा सकता है । पूरा एपी के बारे में 12 से 24 नमूनों का एक सेट के लिए 4-6 एच लेता है, हमारे प्रोटोकॉल के मध्य प्रवाह विश्लेषण के लिए उपयुक्त प्रतिपादन ।
प्रोटोकॉल, समग्र सीधा होने के बावजूद, महत्वपूर्ण कदम के एक नंबर है । (i) इनपुट प्रोटीन और संबध मोतियों की पर्याप्त मात्रा में metabolite का पता लगाने के एक गतिशील रेंज तक पहुंचने के लिए महत्वपूर्ण है । कुशल कोशिका lysis इसलिए प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है । गरीब प्रोटीन पैदावार सामग्री या इष्टतम lysis-बफर/सामग्री अनुपात के अपर्याप्त चूर्णन का परिणाम हो सकता है । (ii) देखभाल की जानी चाहिए कि इस्तेमाल किया एजेंट एमएस के अनुकूल हैं । मजबूत डिटर्जेंट, ग्लिसरॉल, या नमक की अत्यधिक मात्रा के रूप में वे एमएस का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप से बचा जाना चाहिए । (iii) Agarose मोतियों की धुलाई चरणों के दौरान खत्म नहीं होना चाहिए, और जब एक निर्वात कई गुना यह एक धीमी प्रवाह की दर को लागू करने के लिए इतना के रूप में मोतियों को नष्ट या जटिल स्थिरता को प्रभावित नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है का उपयोग कर ।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए कुछ महत्वपूर्ण संभव संशोधनों हैं: (i) हम गठन CaMV35S प्रमोटर का उपयोग करने के लिए चारा प्रोटीन की मात्रा को अधिकतम । बहुत उपयोगी है, जबकि व्यक्त, सेल homeostasis28 पर गंभीर प्रभाव है और शारीरिक रूप से अप्रासंगिक बातचीत के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । टैग की अभिव्यक्ति प्रोटीन देशी प्रवर्तकों का उपयोग कर और जहां एक नुकसान में संभव-समारोह पृष्ठभूमि सही जैविक सूचना प्राप्त करने के लिए बेहतर माना जाता है । प्रोटीन के लिए आम तौर पर संयंत्र सेल संस्कृतियों में व्यक्त नहीं, एक संयंत्र पृष्ठभूमि प्रासंगिक बातचीत की पहचान करने के लिए आवश्यक साबित हो सकता है । (ii) झिल्ली प्रोटीन के साथ काम करते समय, lysis बफर एक एमएस-संगत डिटर्जेंट के साथ पूरक होने की जरूरत है । (iii) एक दूसरे संबध का परिचय-शुद्धि चरण सही-सकारात्मक अनुपात के लिए झूठी-सकारात्मक सुधार और EV नियंत्रण29की जरूरत को खत्म कर सकता है । दो स्वतंत्र के साथ एक उपंयास मिलकर टैग-दरार साइटों आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी कदम के लिए एक आकर्षक विकल्प प्रस्तुत करता है माएदा एट अल. २०१४11है, जो दोनों श्रमसाध्य और समय लगता है द्वारा जोड़ा गया ।
एपी की सबसे गंभीर खामी झूठी सकारात्मक की उच्च दर है । कारण अनेक होते. गठन से पहले ही स्पष्ट उल्लेख किया गया था । शारीरिक अप्रासंगिक बातचीत का एक अंय स्रोत है, जब तक पृथक organelles के साथ काम कर रहे, पूरे सेल lysates प्रोटीन और चयापचयों के विभिंन उपसेलुलर डिब्बों से युक्त मिश्रण की तैयारी है । सेलुलर स्थानीयकरण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए के लिए फ़िल्टर सच है । फिर भी, विशिष्ट प्रोटीन और agarose रेजिन के बीच बंधन से झूठी सकारात्मक परिणाम के बहुमत । एक दूसरे शुद्धि कदम का परिचय, जैसा कि ऊपर वर्णित है, समस्या का सबसे अच्छा समाधान प्रदान करता है, लेकिन समय और प्रवाह की कीमत पर आता है । इसके अलावा, कमजोर बातचीत के रूप में प्रोटोकॉल लंबा खो सकता है । एपी का एक और चेतावनी है कि व्यापक जानकारी के बावजूद यह एक लक्ष्य प्रोटीन के interactome के बारे में प्रदान करता है, चारा प्रोटीन के प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष लक्ष्यों के बीच अंतर असंभव है । लक्षित bimolecular दृष्टिकोण को बातचीत की पुष्टि की जरूरत है ।
एमएस के साथ मिलकर एपी आधारित metabolomics एस cerevisiae12 में प्रोटीन परिसरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह काम, साथ में हमारे पहले अवलोकन13 कि, लिपिड के लिए इसी तरह, ध्रुवीय और अर्द्ध ध्रुवीय यौगिकों प्रोटीन परिसरों सेलुलर lysates से पृथक करने के लिए बाध्य रहते हैं, प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए वैचारिक आधार प्रदान की है । हमारे प्रोटोकॉल तीन अद्वितीय अंक की विशेषता है: (मैं) खमीर12काम करने के लिए इसके विपरीत, यह दर्शाता है कि एपी न केवल hydrophobic लेकिन यह भी हाइड्रोफिलिक प्रोटीन लाइगैंडों वापस लाने के लिए उपयुक्त है । (ii) एक तीन में एक निष्कर्षण प्रोटोकॉल शुरू करने से, एक एपी के लिए प्रोटीन और चारा प्रोटीन के metabolite के इंटरैक्टर्स का अध्ययन किया जा सकता है । (iii) हम संयंत्र कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित ।
भविष्य के प्रयासों के साथ एक उपंयास मिलकर टैग बनाने पर ध्यान केंद्रित करेंगे दो स्वतंत्र टीज़-दरार साइटों । हम भी कम बहुतायत छोटे अणुओं जैसे संयंत्र हार्मोन के लिए प्रोटोकॉल की उपयुक्तता का पता लगाने के लिए करना चाहते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
हम कृपया चाहते है कि परियोजना, उत्पादक चर्चा, और महान पर्यवेक्षण में उनकी भागीदारी के लिए प्रो Dr. लोथार Willmitzer स्वीकार करते हैं । हम proteomic एमएस माप के साथ मदद करने के लिए डॉ डैनियल Veyel के लिए आभारी हैं । हम श्रीमती Änne Michaelis जो हमें नियंत्रण रेखा-एमएस माप के साथ अमूल्य तकनीकी मदद प्रदान की सराहना करते हैं । इसके अलावा, हम उनकी मदद और मूल पांडुलिपि पर काम में शामिल करने के लिए डॉ मोनिका Kosmacz और dr. Ewelina Sokołowska शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और तकनीकी सहायता के लिए Jasińska Weronika ।
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics | Sigma-Aldrich | M6899 | |
1-Naphthylacetic acid | Sigma-Aldrich | N1641 | |
Kinetin solution | Sigma-Aldrich | K3253 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
MgCl2 | Carl Roth | 2189.1 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 3609 | |
NaF | Sigma-Aldrich | S6776 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
E-64 protease inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
Na3VO4 | Sigma-Aldrich | S6508 | |
AcTEV Protease | Thermo Fischer Scientific | 12575015 | |
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.2 | |
TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fischer Scientific | 26616 | |
SBP Tag Antibody (SB19-C4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-101595 | |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
MTBE | Biosolve | 138906 | |
Methanol | Biosolve | 136806 | |
Water | Biosolve | 232106 | |
Acetonitrile | Biosolve | 12006 | |
Trifluoroacetic acid | Biosolve | 202341 | |
Formic acid | Biosolve | 69141 | |
Unimax 2010 Platform Shaker | Heidolph | 5421002000 | |
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%) | Prosepa | Custom order | |
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml | Restek | KT953751-0000 | |
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St | VWR International GmbH | 514-0340 | |
Mixer Mill MM 400 | Retsch GmbH | 207450001 | |
IgG Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0969-02 | |
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters | MoBiTec GmbH | M1002 | |
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053 | MoBiTec GmbH | M513515 | |
Variable Speed Tube Rotator SB 3 | Carl Roth | Y550.1 | |
Rotary dishes for rotators SB 3 | Carl Roth | Y555.1 | |
Resprep 24-Port SPE Manifolds | Restek | 26080 | |
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml | Teknokroma | TR-F034000 | |
Autosampler Vials | Klaus Trott Chromatographie-Zubehör | 40 11 01 740 | |
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column | Thermo Fischer Scientific | 164534 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | Thermo Fischer Scientific | LC120 | |
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Fischer Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
Acquity UPLC system | Waters | Custom order | |
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg | Waters | 186003533 | |
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions | Bandelin | RK 31 | |
Genedata Expressionist | Genedata | NaN | |
Xcalibur Software | Thermo Fischer Scientific | NaN | |
MaxQuant | NaN | NaN |