2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Summary

Protein-protein och protein-metaboliten interaktioner är avgörande för alla cellulära funktioner. Häri, beskriver vi ett protokoll som möjliggör parallell analys av dessa interaktioner med ett protein val. Våra protokoll var optimerad för växt cellkulturer och kombinerar affinitet rening med massa spektrometri-baserade protein och metaboliten upptäckt.

Abstract

Cellulära processer regleras av samspelet mellan biologiska molekyler som proteiner, metaboliter och nukleinsyror. Utredningen av protein-protein interaktioner (PPI) är ingen nyhet, utgör experimentella metoder som syftar till att karakterisera endogen protein-metaboliten interaktioner (PMI) en ganska nyligen utveckling. Häri, presenterar vi ett protokoll som tillåter samtidig karakterisering av PPI och PMI ett protein val, avses som bete. Våra protokoll var optimerad för Arabidopsis cell kulturer och kombinerar affinitet rening (AP) med masspektrometri (MS)-baserat identifiering av protein och metabolit. Kort sagt, är transgena Arabidopsis linjer, uttrycker bete protein smält till en affinitet tagg, först lyserat för att erhålla en native cellulära extrakt. Anti tagg antikroppar används för att dra ner protein och metaboliten partners av proteinet bete. Affinitet-renat komplexen extraheras med hjälp av en one-step metyl tert-butyl ether (MTBE) / metanol/vatten-metoden. Samtidigt metaboliter separera i antingen den polära eller fasen hydrofoba, kan proteiner hittas i pelleten. Både metaboliter och proteiner analyseras sedan av ultra-prestanda liquid chromatography-masspektrometri (UPLC-MS eller UPLC-MS/MS). Tom-vektor (EV) kontroll linjer används för att utesluta falska positiva. Den stora fördelen med våra protokoll är att det möjliggör identifiering av protein och metaboliten partners ett målprotein parallellt i nära-fysiologiska förhållanden (cell lysate). Den presenterade metoden är enkelt, snabbt och enkelt kan anpassas till biologiska system än växt cellkulturer.

Introduction

Metoden som beskrivs här syftar på identifiering av metaboliten och protein partner av ett protein av val i nära –in vivo – cell lysate villkor. Det har spekulerats att många fler metaboliter än kännetecknas idag har en viktig reglerande funktion¹. Metaboliter kan fungera som biologiska växlar, ändra den aktivitet, funktionalitet eller lokalisering av sin receptor protein^2,3,4. Under det senaste decenniet har flera genombrott metoder, som möjliggör identifiering av PMI i vivo eller i nära –in vivo – förhållanden, varit utvecklade⁵. Tillgängliga metoder kan delas in i två grupper. Den första gruppen består av tekniker som startar med en känd-metaboliten bete för att fånga roman protein partners. Metoder inkluderar affinitet kromatografi⁶, drog affinitet lyhörd mål-stabilitet analys⁷, kemo-proteomik⁸och termisk proteomet profilering⁹. Den andra gruppen består av en enda metod som börjar med en känd protein för att identifiera småmolekylär ligander^10,11.

AP tillsammans med MS-baserad gammaldags användes för att analysera protein-lipid komplex i Saccharomyces cerevisiae¹². Som utgångspunkt, författarna använde jäststammar som uttrycker 21 enzymer som är involverade i ergosterol biosyntes och 103 kinaser smält till en tandem affinitet rening (TAP) tag. 70% av enzymer och 20% av kinaser konstaterades för att binda olika hydrofoba ligander, sprider ljus i intrikata protein-lipid interaktion nätverket.

Tidigare kunde vi visa att likaså att lipider, polar och semi polära föreningar också förbli bundet till proteinkomplex isolerade från den cellulära lysates¹³. Baserat på dessa fynd, beslutade vi att optimera AP metod tidigare publicerade^10,11 för växtceller och hydrofil föreningar¹⁴. För detta ändamål använde vi TAP vektorer beskrivs av Van Leene et al. 2010, framgångsrikt används i anläggningen PPI studier¹⁵. För att förkorta den tid som krävs för att erhålla transgena linjerna, bestämde vi oss på Arabidopsis cellkulturer. Vi anställt en one-step metyl tert-butyl ether, (MTBE) / metanol/vatten utvinning metod, vilket gör att karakterisering av proteiner (pellets), lipider (organiska fasen) och hydrofila metaboliter (vattenfas)¹⁶ i en enda affinitet-rening experiment. EV kontroll linjer infördes för att utesluta falska positiva, e.g. proteiner som binder till taggen ensam. Som bevis på koncept vi taggade tre (av fem) nukleosid diphosphate kinaser presentera i Arabidopsis genomet (NDPK1-NDPK3). Bland andra fynd kunde vi visa att NDPK1 interagerar med glutation S-transferas och glutation. Följaktligen kunde vi bevisa att NDPK1 utsätts för glutathionylation¹⁴.

Sammanfattningsvis redovisade protokollet är ett viktigt verktyg för karaktärisering av protein-protein och protein-småmolekylär interaktion nätverk och utgör ett stort framsteg jämfört med befintliga metoder.

Protocol

Beredning av transgena Arabidopsis kultur cellinjer, inklusive kloning, omvandling, urval och tillväxt villkor kan hittas i17. Observera att EV kontroll linjer rekommenderas att korrigera för falska positiva. Innan experimentet, bekräfta överuttryck av proteinet bete genom western blot analys, t.ex. med hjälp av IgG antikroppar mot den G-protein delen av taggen tandem affinitet. Det är viktigt att skilja tillväxt medier från cell kultur växtmaterial. 1. förbereda Cell växtmaterialet innan experimentet Växer en PSB-L A. thaliana kultur cellinje överuttryck proteinet av intresse18. Förbereda MSMO medium, som innehåller 4,43 redov MSMO blandat med 30 g/L sackaros. Justera pH-värdet i bufferten till 5,7 med 1 M KOH och autoklav lösningen. Innan experimentet, komplettera mediet med 0,5 mg/L α-naphthaleneacetic syra, 0,05 mg/L kinetin och 50 μg/mL kanamycin. Odla transformerade växten cellkulturer i 50 mL MSMO medium i en 100 mL mätkolv på en orbital plattform shaker med mild agitation (130 rpm). Odla cellerna i ett kultur rum vid 20 ° C och ljusintensiteten motsvarar 80 μmol m-2 s-1. Subkultur celler in färska media varje 7 dagar, att späda dem 1:10. Samla celler på logaritmisk tillväxtfasen använder en glastratt kombinerat med en vakuumpump, använder en nylon mesh som filter. Linda infiltrera i aluminiumfolie och frysa i flytande kväve.Varning: Kom ihåg att flytande kväve är extremt kallt. Felaktig hantering kan orsaka brännskador. Använd lämplig personlig skyddsutrustning, inklusive Termiskt isolerade handskar, skyddsglasögon och en labbrock. 2. Tryck på protokoll Obs: Följande steg är anpassad från Maeda et al. 201411 och Van Leene et al. 201117. Homogenisera skördade och frysta cell kultur växtmaterial med hjälp av en mixer kvarn (2 min vid 20 Hz) eller mortel och stöt för att få fint pulver. Alikvotens 3 g av marken material (motsvarande cirka 90 mg totalprotein) per prov. Undvika upptining av provet under detta steg genom att använda flytande kväve före kyld utrustning.Obs: Store marken växtmaterial i 50 mL tub vid – 80 ° C till början av ett förfarande för AP. Pulverisera provet i en vätska-kväve-förhandskyld mortel med 3 mL iskallt lyseringsbuffert (0,025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl 1,5 mM MgCl20,5 mM DTT; 1 mM NaF; 1 mM Na3VO4; 100 x utspädda kommersiella proteashämmare cocktail; 1 mM PMSF) tills materialet tinar. När provet blidväder, genast fortsätta till nästa steg.Obs: Förbereda Lys buffert färska. Införa tom prover vid detta steg. Rengöringsmedel rekommenderas inte eftersom de kan orsaka problem i MS upptäckt. Ta bort cellulära skräp, dela upp materialet i 2 mL mikrocentrifugrör och centrifugera vid 20,817 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Samla 3 mL av den klara lysate i en 15 mL koniskt centrifugrör. Under centrifugeringssteget, temperera IgG-Sepharose pärlor. Alikvotens 100 µL av pärlor per prov och tvätta dem med 1 mL lyseringsbuffert. Vortex att resuspendera pärlor och flash-spin. Kassera lyseringsbuffert och upprepa detta två gånger. Återsuspendera pärlor i 400 μl lyseringsbuffert. Lägga till pärlor i insamlade växten lysate och inkubera blandningen på ett roterande hjul för 1 h vid 4 ° C. Överföring blandningen i en spruta kombinerat via Luer-Lockhatten med en spin kolumn med filter porstorlek storlek 35 µm. Tryck att passera den lysate genom. Pärlor med bifogade komplex förblir på Filtrera, medan den lysate kommer att gå igenom.Obs: Använd eventuellt ett grenrör vakuumsystem. Göra säker till applicera lätt tryck så att inte skada pärlorna. Tvätta pärlor först med 10 mL tvätt buffert (0,025 M Tris-HCl pH 7,5; 0,5 M NaCl), och därefter med 1 mL eluering buffert (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1000 x utspädda E64 och 1 mM PMSF). Utföra tvättning med en spruta som bifogas den kolumnen eller grenrör vakuumsystem.Obs: När använda ett grenrör vakuumsystem göra vissa att tillämpa lätt tryck så att inte skada pärlorna. Inkubera pärlor med 400 µL av eluering buffert innehållande 50 U i en förbättrad version av tobaken etch virus (AcTEV) proteashämmare. Använd tabell shaker vid 1000 rpm för 30 min vid 16 ° C.Obs: Kom ihåg att använda en plugg för att stänga kolumnen längst lägga eluering bufferten. Lägga till en extra portion (50 U) av enzymet i kolonnen och inkubera den blandningen för nästa 30 min under samma, beskrivs ovan villkor. Samla eluatet i en 2 mL mikrocentrifug rör genom centrifugering (1 min, 20,817 x g) eller vakuum grenrör. Ta bort återstående komplex, införa ett ytterligare eluering steg med 200 µL eluering buffert.Obs: Förvara provet vid – 20 ° C eller – 80 ° C, eller genast fortsätta till protein och metaboliten utvinning steg. Tina frysta prover på is. 3. Western Blot analys Bekräfta förekomsten av betet använda protein i insamlade eluatet 10 µL – metabolit proteinhaltiga eluatet för att utföra SDS-PAGE och western blot analys. För att identifiera proteinet av intresse, använda mus primära antikroppar mot streptividin-bindande protein (1: 200), en del av taggen TAP återstår efter TEV proteas klyvning, som beskrivs i Van Leene et al. 201117. Använd sekundära get anti-mus-antikroppar tillsammans med HRP. 4. metabolit och Protein utvinning Obs: Detta protokoll är anpassad från Giavalisco et al. 201116. Obs: Från detta steg framåt använda UPLC – MS – grade lösningar. Tillsätt 1 mL av metyl tert-butyl ether (MTBE) / metanol/vatten lösningsmedel (3:1:1) till insamlade eluatet och blanda provet genom inversion. Kontrollera att vätskan kyls till – 20 ° C före steget extraktion.FÖRSIKTIGHET: MTBE och metanol är skadliga ämnen. Utför utvinning steg under spiskåpa och bära lämplig personlig skyddsutrustning, exempelvis handskar. Lägga till 0,4 mL metanol: vatten 1:3 lösning till varje prov och blanda innehållet i provet genom inversion.Obs: Tillskott av blandningen med metanol: vatten lösning resulterar i fasseparation. Den övre fasen innehåller lipider, lägre fas innehåller polära och semi polära metaboliter och proteiner kan hittas i pelleten. Att separera faserna, Centrifugera provet vid 20,817 x g under 2 minuter vid rumstemperatur och sedan samla in den övre fasen för lipid mätningar (inte göras i detta protokoll) med manuell vätskehantering pipett med 1 mL volymkapacitet. Tillsätt 0,2 mL metanol och blanda genom inversion. Centrifugera provet vid 20,817 x g under 2 minuter vid RT och sedan samla fasen polar för metaboliten mätningar (polära och semi polära föreningar). För att undvika störande protein pelleten, lämna ca 50 µL av den flytande fasen på botten av röret. Torra insamlade prover för metaboliten mätningar över natten i en centrifugal förångare. Undvik uttorkning protein pellets genom att ta bort prover från förångaren efter 30 – 60 min.Obs: Lagra prover vid – 20 ° C eller – 80 ° C, eller omedelbart fortsätta med utarbetandet av proteiner för LC-MS/MS-analys. 5. förbereda prover för proteomiska analys Obs: Detta steg är anpassade från Olsen et al. 200419 och den tekniska manualen Trypsin/Lys-C mix (se Tabell för material). Utföra enzymatisk nedbrytning av provet.Försiktighet: Lösningsmedel används under enzymatisk nedbrytning och avsaltning av provet är skadliga. Arbeta under spiskåpa och bära lämplig personlig skyddsutrustning, exempelvis handskar. Lös upp protein pellets i 30 µL av nylagade denaturering buffert (40 mM hjorthornssalt innehållande 2 M tiourea/6 M urea, pH 8). För att uppnå bättre protein löslighet, utföra en 15-min ultraljudsbehandling steg. Upprepa steget tills pelleten upplöser. Centrifugera provet vid 20,817 x g under 10 minuter vid 4 ° C och sedan överföra supernatanten till ett nytt mikrocentrifug rör. Bestämma proteinkoncentration med Bradford protein analys. För ytterligare analyser, alikvotens en volym motsvarande 100 µg av protein och fyll provet upp till 46 µL med denaturering buffert. Lägg till de prov 2 µL av nylagade minskning buffert (50 mM DTT upplöst i H2O) och inkubera i 30 min i rumstemperatur. Behandla provet med 2 µL av nylagade alkylering buffert (150 mM iodoacetamide upplöst i 40 mM hjorthornssalt buffert) och inkubera blandningen i mörkret under 20 minuter vid rumstemperatur. Späd provet med 30 µL av 40 mM hjorthornssalt buffert och tillsätt 20 µL av LysC/Trypsin Mix. Efter 4 h inkubation vid 37 ° C, späd provet med 300 µL av 40 mM hjorthornssalt buffert. Fortsätta med natten inkubation vid 37 ° C. Gör filtratet surt provet med cirka 20 µL 10% trifluorättiksyra (TFA) att få pH < 2. Kontrollera provets pH med hjälp av en pH-remsa.Obs: Förvara provet vid – 20 ° C eller gå vidare till nästa steg. Avsalta smälta proteiner.Obs: Använd helst, ett grenrör vakuumsystem. Undvik uttorkning av kolumnen. Skölj kolumnen C18 SPE (se Tabell för material) med 1 mL 100% MeOH och därefter med 1 mL 80 procent acetonitril (ACN) som innehåller 0,1% TFA spädas i vatten. Användning, här och i ytterligare protein-avsaltning steg, ett grenrör vakuumsystem att påskynda processen. Undvik uttorkning av kolumnen. Jämvikta kolonnen genom att tvätta det två gånger med 1 mL 0,1% TFA utspätt i vatten. Fyll provet på kolumnen. Skölj röret med ytterligare 200 µL 0,1% TFA och överföra lösningen på kolumnen. Kör lösningarna genom kolonnen. Tvätta kolonnen två gånger med 1 mL 0,1% transfettsyror. Eluera desalted peptider från kolonnen med 800 µL av 60% ACN, 0,1% TFA lösning. Torka den insamlade fraktionen i en centrifugal förångaren, undvika uttorkning av andelen protein genom att ta bort prover från förångaren efter 30 – 60 min.Obs: Lagra prover vid – 20 ° C eller – 80 ° C eller genast fortsätta till nästa steg. I efterföljande steg, hålla prover på is. 6. mätning beredd Protein prover med UPLC – MS/MS. Obs: Före proteomiska och metabolomiska mätningar, filtrera (0,2 µm porstorlek) och lufta alla buffertar med hjälp av en vakuumpump för 1 h. Återsuspendera torkade peptid pellets lagras i 2 mL mikrocentrifug rör i 50 µL buffert C (3% v/v ACN, 0,1% v/v myrsyra) använder manuell vätskehantering pipett med 200 µL volymens kapacitet. Sonikera prover i 15 minuter i ett ultraljudsbad med 35 kHz ultraljud frekvens.Varning: ACN och myrsyra är skadliga ämnen. Arbeta under spiskåpa och bära lämplig personlig skyddsutrustning, exempelvis handskar. Centrifugera provet vid 20,817 x g under 10 minuter vid 4 ° C och sedan överföra 20 µL av supernatanten till en injektionsflaska av glas. Separat smält peptider med en kolonn med omvänd fas C18 ansluten till en vätskekromatografi och förvärva masspektra med en masspektrometer. Separat på kolumn 3 µL av provet med en 300-nl/min flödeshastighet. För en rörlig fas, använda buffert C och D (63% v/v ACN, 0,1% v/v myrsyra), bildar en lutning ramp från 3% ACN till 15% ACN över 20 min och sedan till 30% ACN över de nästa 10 min.Obs: Förvara resten av provet vid – 20 ° C eller – 80 ° C upp till några månader. Frys igen provet på is före proteomiska mätning. Tvätta föroreningar ut i 10 min med 60% ACN och låt jämvikta kolonnen med 5 µL buffert C före mätning av nästa provet. Få masspektra med data-beroende MS/MS metod med upplösningen inställd på 70.000, AGC mål på 3e6 joner, maximal injektion tid 100 MS, och en m/z allt från 300 till 1600. Förvärva högst 15 MS/MS genomsökningar på en upplösning av 17.500, AGC mål 1e5, maximal injektion tid 100 MS, gjuthartser baserat på 20%, med isolerat fönster 1.6 m/z och m/z alltifrån 200 till 2000. Aktivera apex trigger (6 – 20 s), Ställ in dynamiska utslagning 15 s, och utesluta avgifter 1 och > 5. 7. behandling av proteomiska Data Ladda ner nyaste Arabidopsis thaliana proteomet databasen från http://www.uniprot.org/ och inkluderar föroreningars databas. Analysera rå data som erhållits från LC-MS körs med MaxQuant med integrerad Andromeda peptid sökmotor använder standardinställningen med aktiverad LFQ normalisering20,21,22. Hitta detaljerad information om parametrar som används i Tabell S1. Öppna filen ”protein groups.txt” utgång. För vidare analys, filter för protein grupper identifieras med minst två unika peptider. Ta bort protein grupper som definieras av MaxQuant som potentiella föroreningar och filter för A. thaliana proteiner (ARATH i Fasta rubriker kolumn) finns kvar i databasen. För att testa betydelsen av protein anrikning mellan prover, använda LFQ normaliserade stödnivåer och utföra oparade, tvåsidiga Students t-test följt av flera jämförelse korrigering (e.g. Benjamini & Hochberg false discovery rate (FDR) korrigering eller Bonferroni korrigering). Beräkna p-värde genom att jämföra LFQ intensitet erhålls för EV kontroll och NDPK1. Filtrera bort alla obestämd värden. Sortera värden i stigande ordning och använda R skript eller online kalkylator (t.ex. https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR) för att beräkna FDR korrigering. Filter för FDR värden under 0,1.Överväg att form av dataanalys lämpar sig för forskning. För kvantitativa studier (analys av protein anrikning mellan prover) Använd ”LFQ” intensitetsvärdet, medan för kvalitativ forskning (närvaron eller frånvaron av visst protein) välja värdet ”intensitet”. Filter för protein-grupper som är mer rikligt i NDPK1 jämföra med EV kontroll. Bestämma localizationen av potentiella protein partners använder SUBA databas23 och rätt för protein Co lokaliserade med NDPK1. 8. mätning av prover som innehåller polära fas med UPLC – MS. Omsuspendera torkade polar fas från steg 4,5 i 200 µL av vatten och Sonikera provet för 5 min. Centrifugera provet vid 20,817 x g under 10 minuter vid 4 ° C och sedan överföra supernatanten till en injektionsflaska av glas.Obs: Förvara resten av provet vid – 20 ° C eller – 80 ° C i upp till flera månader. Frys igen provet på is före metabolomiska mätning. Utföra en separation steg med hjälp av UPLC kopplat till C18 kolonn med omvänd fas och förvärva masspektra med MS. Lasta på den kolumn 2 µL av provet per injektion för varje jonisering läge (positiva och negativa) och separata bråket med 400 µL/min-flöde. För att skapa krävs övertoningen för metaboliten mätning, förbereda mobil fas lösning enligt följande: buffert en (0,1% myrsyra i H2O) och buffert B (0,1% myrsyra i ACN). Separata metaboliter på 400 µL/min och följande övertoningen: 1 min 99% av buffert A, 11-min linjär gradient från 99% av buffert A till 60% av buffert A, 13-min linjär gradient från 60% av buffert A till 30% av buffert A, 15-min linjär gradient från 30% av buffert A till 1% Håll koncentration av 1% av bufferten A, tills 16 min. start från 17 min, Använd linjär gradient från 1% av buffert A till 99% av buffert A. åter jämvikta kolonnen för 3 min med 99% koncentration av buffert A före mätning av nästa provet. Förvärva masspektra täcker massa intervall mellan 100 och 1500 m/z med upplösningen inställd på 25.000 och laddningstid är begränsad till 100 ms. ställa AGC mål till 1e6, kapillär spänning till 3kV med en slida gas flöde och extra gas värde 60 och 20 , respektive. Ange kapillär temperaturen till 250 ° C och skimmer spänning till 25V. 9. behandling av Metabolomics Data Processen samlat kromatogram som förvärvats från båda jonisering lägena. Använda programvara för att extrahera mass avgift baserat (m/z), retentionstid (RT) och intensiteten av associerade toppar, t.ex. kommersiell programvara (se Tabell för material) eller alternativa24. Starta bearbetning programvara genom att dubbelklicka på .exe-filen Skapa nytt arbetsflöde, söka efter aktivitet ”Läs in från fil” och flytta denna verksamhet av ”drag and drop” i tomt arbetsflöde utrymme. Tryck på aktiviteten med höger musknapp och öppna Inställningar för aktiviteten. I fliken som innehåller ”allmänna” inställningar, ange ett namn för experimentet i fältet ”namn” och Nästa klicka ”Välj filer och mappar” och markera raw kromatogrammen. I fliken som innehåller ”Avancerat” inställningar, ange ”profil Data Cutoff” till 0 intensitet. Klicka på ”Apply” och ”OK”. Sök efter och Lägg till aktivitet ”Data Sweep”. Tryck på aktiviteten med höger musknapp och öppna Inställningar för aktiviteten. I fliken som innehåller ”allmänna” inställningar, markera ”centroiden data” och ”MS/MS Data”. Ta bort alla MS/MS data genom att välja ”allt” i urvalsjuryn. Sök efter och Lägg till aktiviteten ”kromatogrammet kemiska buller subtraktion”. Tryck på aktiviteten med höger musknapp och öppna Inställningar för aktiviteten. I fliken som innehåller ”allmänna” inställningar, markera ”kromatogrammet utjämning” och Ställ in antal skanningar till ”3” och ”Estimator” till ”glidande medelvärde”. Ange ”RT fönster” till 51 skanningar, ”Quantile” till 50%, subtraktion ”metod” och 750 intensitet ”tröskel”. I fliken som innehåller ”Avancerat” inställningar, markera ”RT struktur borttagning” och ange ”minsta RT längd” till 5 skanningar. I fliken som innehåller ”avancerade” inställningar, markera ”m/z struktur borttagning” och Ställ in ”Minimum m/z längd” 3 punkter. Sök efter och Lägg till aktiviteten ”kromatogrammet RT justering”. Tryck på aktiviteten med höger musknapp och öppna Inställningar för aktiviteten. I fliken som innehåller ”allmänna” inställningar, ange ”Alignment system” till ”Pairwise justering Base träd” och ”RT Sökningsintervall” till 0,5 min. I fliken som innehåller ”Avancerat” inställningar, använda standardparametrar. Sök efter och Lägg till aktiviteten ”Peak Detection” i ”kromatogrammet” grupp av aktiviteter. Tryck på aktiviteten med höger musknapp och öppna Inställningar för aktiviteten. I fliken som innehåller ”allmänna” inställningar, ange ”summering fönster” till 0,09 min, ”minst topp storlek” till 0,03 min, ”maximal sammanfoga avstånd” till 5 Poäng och ”sammanfoga strategi” för att ”Centers”. I ”Peak RT uppdelningen av” ställa in ”Gap/Peak Ratio” till 50%. I fliken som innehåller ”Avancerat” inställningar, anger du ”Smoothing fönster” till 5 punkter, ”förfining tröskeln” till 80% och ”konsistens tröskel” till 1. Ange ”Center uträkningen” som ”intensitet-viktat” med ”intensitet tröskel” inställd på 70%. Sök efter och Lägg till aktiviteten ”isotop kluster” i ”kromatogrammet” grupp av aktiviteter. Tryck på aktiviteten med höger musknapp och öppna Inställningar för aktiviteten. I fliken ange som innehåller ”allmänna” inställningar, ”RT tolerans” till 0,015 min och ”m/z tolerans” till 5 ppm. I fliken ange som innehåller ”kuvert montering” inställningar, ”metod” som ”nr form begränsningen” och ”jonisering” som ”Protonation (för positivt läge) och” Deprotonation ”(för negativa läge). Som ”lägsta och högsta avgift” 1 och 4, respektive. I fliken som innehåller ”Avancerat” inställningar, använda standardparametrar. Sök efter och Lägg till aktivitet ”Singleton Filter”. För att exportera resultaten av databehandling, söka efter och lägga till aktiviteten ”analytiker” i ”Exportera” grupp av aktiviteter. I fliken som innehåller ”allmänna” inställningar, ange ”typ” som ”kluster” och ”observerbara” som ”sammanfattade intensitet”. Välj ”anpassad Destination” och ange katalog i exportfilen. I fliken som innehåller ”Avancerat” inställningar, använda standardparametrar. Kommentera massa funktioner använder intern referens-förening-databas. Analysera en eller flera MS grade referens-förening UPLC-MS. använda samma LC-MS metod för analys av referens-föreningar och metaboliter Co renas med protein av intresse.Obs: För denna studie var en uppsättning nästan 300 dipeptider analyseras och användas som referens-förening bibliotek. Använd analys (se Tabell för material) programvaran för att öppna raw kromatogrammet fil och Sök för specifika m/z och RT associerade med mätt referens-förening (se bruksanvisning).Obs: Sekundära metaboliter har olika typer av jonisering. Kontrollera om förekomsten av gemensamt addukter genom att söka efter ion mass lika med M-1.007276, M + 1.007276, M + 18.033823 M + 22.989218 för [M-H], [M + H], [M + NH4] och [M + Na], respektive. Använd kalkylbladet att öppna exporterad ”analytiker” fil erhålls efter bearbetning av kromatogram och Sök efter specifika ion mass. Jämföra RT av funktionen massa mätt i experiment och RT av referens föreningen. Tillåt en avvikelse av 0,005 Da för m/z och 0.1 min för RT. För att testa betydelsen av metaboliten berikande samarbete renas med visst protein mellan prover (linje med överuttryckt protein intresse vs EV kontroll), jämför toppvärden som använder två icke-parat Students t-test följt av flera jämförelse korrigering (e.g. Benjamini & Hochberg falsk upptäckten hastighet korrigering eller Bonferroni korrigering).

Representative Results

I den ursprungliga studien var tre A. thaliana NDPK gener i ökad utsträckning i PSB-L suspension cellodlingar under kontroll av den konstituerande 35S arrangör14 (figur 1). Tandem affinitet tag var smält till ände karboxi – eller amino-terminal av ett protein som bete. Affinitet-renat komplexen utsattes för MTBE/metanol/vatten extraktion16. Affinitet-drog proteiner och små molekyler identifierades med hjälp av MS (tabeller S2 och S3). För att korrigera för falsklarm, användes tom prover att utesluta småmolekylär föroreningar från kemikalier och laboratorium förbrukningsvaror. Dessutom var metaboliter och proteiner som binder till antingen en affinitet-tagg eller harts ensam stod för med hjälp av EV kontroll linjer. Om du vill hämta sant positiva, två icke-parat Students t-test och Benjamini & Hochberg falsk upptäckten hastighet tillämpades korrigering för att identifiera metaboliter (Tabell S4) och proteiner (Tabell S5) avsevärt berikad i NDPKs AP experiment (N – och C-obotligt märkta NDPKs) i jämförelse med EV kontroll linjer (FDR < 0,1). Observera att i tidigare arbete, vi frånvaro/närvaro kriterier för att avgränsa protein och småmolekylär interactmedlemmar. Representativa resultat ges för NDPK1, medan metabolit data fokus på dipeptider, en ny klass av småmolekylär tillsynsmyndigheterna studerade i vår grupp. Proteomiska analysen visade 26 förmodad protein partner av NDPK1. Genom ytterligare filtrering för proteiner Co lokaliserade i samma subcellulär avdelning som NDPK1 (cytosol), listan minskat till 13 förmodad protein interactmedlemmar. Bland de identifiera proteinerna var glutation S-transferas, två töjning inledande faktorer, tubulin och aconitate hydratase. Metabolomiska analys visade fyra dipeptider Val-Leu, Ile-Glu, Leu-Ile och Ile-Phe som specifikt samarbete elueras med NDPK1 (figur 2). Observera att alla fyra dipeptider delar en hydrofoba rester i sin N-terminalen, vilket tyder på delade bindande specificitet. Leta efter kända protein-protein och protein-metaboliten komplex vi identifierade efterfrågade 13 proteiner och fyra dipeptider mot Stitch databas25 (figur 3). Flera observationer kunde göras: (i) ingen av interactmedlemmarna tidigare redovisats för NDPK1. (ii) APX1 ortholog rapporterades att interagera med aldehyd dehydrogenas familjemedlem ALDH7B4, medan översättning inledande faktor FBR12 med en annan översättning inledande faktor kodas av genen AT2G40290. (iii) identifierade dipeptider har inte rapporterat protein partners. Co eluerade dipeptider rapporterades inte tidigare som är associerade till någon Hämtad växtprotein. Men de spelar viktiga roller i andra organismer: Leu-Ile, t.ex., har en neurotrophin-aktiverande effekt i en mänsklig cell linje26. Observera att experimentet inte tillåter att identifiera den exakta topologin av systemet. Exempelvis en dipeptid kan interagera direkt med NDPK1 men kan också vara relaterade till någon av de Co renade proteinerna. Sammantaget våra resultat visar att det fastställda förfarandet, anställa AP tillsammans med masspektrometri, underlättar identifiering av protein-protein och protein-småmolekylär interactmedlemmar och hjälper generera omfattande information om de interactome av målproteinet. Figur 1. Ordningen av AP-MS arbetsflöde. (A) beredning av en infödd lösliga fraktionen från plant cellkultur. (B) nästa steg i förfarandet för AP. Efter lastning provet på kolumnen, binder proteinet av POI (INTRESSEPUNKT) smält en TAP-taggen till de IgG-antikropp orörlig på agaros pärlor. Tvättning av kolumnen underlättar borttagning av obundna proteiner och metaboliter. Efter att ha utfört AcTEV klyvning, elueras POI protein-metaboliten komplex. (C) Separation av komplex till protein och metaboliten bråk följt av semikvantitativt MS analys. En del av denna siffra är Reproducerad från Luzarowski et al. 201714. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2. Dipeptider specifikt samarbete eluering med NDPK1. Genomsnittliga stödnivåerna fyra dipeptider Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)och Ile-Phe (D) mätt i AP experiment var inritade. Alla fyra dipeptider Visa betydande anrikning i NDPK1 prover jämfört med EV kontroll (asterisker representerar FDR < 0,1). Felstaplar representera standardfelet för 6 mätningar (3 replikat för N- och 3 i C-obotligt märkta proteiner). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3. Interaktion nätverk av alla molekyler Co eluering med NDPK1, frågas mot STITCH databas med tanke på bara tidigare experimentella och databasen bevis (förtroende > 0,2). Högre förtroende indikerar större chanser att interaktion och beräknas på grundval av deponerade data. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Tabell S1. MaxQuant utgång tabellen ”parameters.txt”. Tabell innehåller tröskelvärden för identifiering och kvantifiering, samt information om databaser som används. Vänligen klicka här för att hämta den här filen. Tabell S2. Information från MaxQuant utgång tabellen ”proteinGroups.txt”. Tabellen innehåller en lista över alla identifierade proteinet grupper, stödnivåer och ytterligare information såsom antal unika peptider och poäng. Vänligen klicka här för att hämta den här filen. Tabell S3. Utdatafilen som innehåller analys av polära metaboliter. Tabell innehåller en lista över alla identifierade massa funktioner som kännetecknas av särskilda m/z, RT och intensitet. Vänligen klicka här för att hämta den här filen. Tabell S4. Dipeptider hittade i AP prover där NDPK1, NDPK2 eller NDPK3 användes som bete. Dipeptider närvarande i tomma prover uteslöts från listan. Två oberoende rader (märkta i antingen N – eller C-terminus) för varje NDPK kördes i tre exemplar. Student’s t-test och ytterligare korrigering av p-värde använder Benjamini & Hochberg metod användes för att fastställa avsevärt berikad Interactmedlemmen partners av NDPKs (FDR < 0,1). Med tanke på beräknas ΔRT i förhållande till den referens föreningar och Δppm i förhållande till den monoisotopic massan anges i Metlin27. Vänligen klicka här för att hämta den här filen. Tabell S5. Proteiner renat tillsammans med NDPK1. Två oberoende rader (märkta i antingen N – eller C-terminus) för varje NDPK kördes i tre exemplar. Student’s t-test och ytterligare korrigering av p-värde använder Benjamini & Hochberg metod användes för att fastställa avsevärt berikad Interactmedlemmen partners av NDPKs (FDR < 0,1). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Presenterade protokollet tillåter parallella identifiering av PP och PM komplexen av ett målprotein. Från kloning till slutresultat, kan experimentet utföras i så lite som 8-12 veckor. Komplett AP tar ca 4-6 h för en uppsättning av 12 till 24 prover, rendering våra protokoll lämplig för mitten av genomströmning analys.

Protokollet, trots att totalt okomplicerad, har ett antal kritiska moment. a tillräcklig mängd indata protein och affinitet pärlor är avgörande för att nå ett dynamiskt spektrum av metaboliten upptäckt. Effektiv cellys är därför ett avgörande steg i förfarandet. Stackars protein avkastningen kan bli en följd av otillräcklig pulvrisering av materialet eller suboptimala baserat på Lys-buffert/material. (ii) bör vara försiktig att använda reagenser är MS-vänlig. Starka rengöringsmedel, glycerol eller överdrivna mängder salt bör undvikas eftersom de stör efter MS upptäckt. (iii) agaros pärlor bör inte vara alltför torkade under tvätt steg, och när du använder ett vakuum grenrör är det viktigt att tillämpa en långsamt flöde så att inte för att förstöra pärlor eller påverka komplexa stabilitet.

Det finns några viktiga eventuella ändringar presenteras protokollet: (i) vi använder konstituerande CaMV35S arrangören för att maximera mängden bete protein. Överuttryck, kan medan mycket användbart, ha allvarliga effekter på cellen homeostas²⁸ och leda till bildandet av fysiologiskt irrelevant interaktioner. Uttrycket av märkta proteiner med hjälp av infödda initiativtagare och där möjligt i en förlust-av-funktion bakgrund anses överlägsen för att hämta sanna biologiska interactmedlemmar. För proteiner som normalt inte uttryckt i växten cellkulturer, kan en växt bakgrund bli nödvändigt att identifiera relevanta interactmedlemmar. (ii) när du arbetar med membranproteiner, behöver lyseringsbuffert kompletteras med en MS-kompatibla rengöringsmedel. (iii) införande av ett andra affinitet-rening steg kunde förbättra falsk-positiv sant positiva förhållande till och eliminera behovet för EV kontroller²⁹. En roman tandem tagg med två oberoende proteas-klyvning platser presenterar ett attraktivt alternativ till storlek-utslagning kromatografi steg till av Maeda et al. 2014¹¹, som är både mödosam och tidskrävande.

Den allvarligaste nackdelen med AP är den höga andelen falskt positiva. Skälen är många. Konstituerande överuttryck nämndes redan. En annan källa till fysiologiskt irrelevant interaktioner, är såvida inte arbetar med isolerade organeller, beredning av hela-cell lysates innehåller blandningar av proteiner och metaboliter från olika subcellulär fack. Subcellulär lokalisering bör användas för att filtrera för sann interactmedlemmar. Dock majoriteten av falska positiva resultat från ospecifik bindning mellan proteiner och agaros hartser. Införandet av ett andra reningssteg, som beskrivits ovan, erbjuder den bästa lösningen på problemet, men sker på bekostnad av tid och genomströmning. Svagare interaktion kan dessutom förloras som protokollet förlänger. En annan varning till AP är att trots den omfattande informationen den ger om interactome av ett målprotein, att skilja mellan direkta och indirekta mål av proteinet agnade är omöjligt. Målinriktade bimolecular strategier behövs för att bekräfta interaktioner.

AP tillsammans med MS-baserad metabolomik användes för att studera protein-komplex i S. cerevisiae¹². Detta verk, tillsammans med våra tidigare observation¹³ att likaså att lipider, polar och semi polära föreningar förbli bundet till proteinkomplex isolerade från cellulära lysates, föreskrivs begreppsmässiga grunden presenterade protokollet. Våra protokoll kännetecknas av tre unika punkter: (i) i kontrast till jästen arbetar¹², visar att AP är lämplig för att hämta inte bara hydrofoba men också hydrofil protein ligander. (ii) genom att införa ett tre-i-en extraktion protokoll, kan en enda AP användas för att studera protein och metaboliten interactmedlemmar av proteinet bete. (iii) vi anpassade protokoll för att plantera celler.

Framtida insatser inriktas på att skapa en roman tandem-tagg med två oberoende proteas-klyvning platser. Vi vill också undersöka lämpligheten av protokollet till låg-överflöd små molekyler som växt hormoner.

Materials

Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics	Sigma-Aldrich	M6899
1-Naphthylacetic acid	Sigma-Aldrich	N1641
Kinetin solution	Sigma-Aldrich	K3253
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
MgCl2	Carl Roth	2189.1
EDTA	Sigma-Aldrich	3609
NaF	Sigma-Aldrich	S6776
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
E-64 protease inhibitor	Sigma-Aldrich	E3132
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P9599
Na3VO4	Sigma-Aldrich	S6508
AcTEV Protease	Thermo Fischer Scientific	12575015
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1)	Carl Roth	3029.2
TEMED	Carl Roth	2367.3
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Fischer Scientific	26616
SBP Tag Antibody (SB19-C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-101595
Goat anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
Bradford Reagent	Sigma-Aldrich	B6916
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade	Promega	V5071
Urea	Sigma-Aldrich	U5128
Thiourea	Sigma-Aldrich	T8656
Ammonium bicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
MTBE	Biosolve	138906
Methanol	Biosolve	136806
Water	Biosolve	232106
Acetonitrile	Biosolve	12006
Trifluoroacetic acid	Biosolve	202341
Formic acid	Biosolve	69141
Unimax 2010 Platform Shaker	Heidolph	5421002000
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%)	Prosepa	Custom order
Glass Funnel, 47 mm, 300 ml	Restek	KT953751-0000
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes St	VWR International GmbH	514-0340
Mixer Mill MM 400	Retsch GmbH	207450001
IgG Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0969-02
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters	MoBiTec GmbH	M1002
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053	MoBiTec GmbH	M513515
Variable Speed Tube Rotator SB 3	Carl Roth	Y550.1
Rotary dishes for rotators SB 3	Carl Roth	Y555.1
Resprep 24-Port SPE Manifolds	Restek	26080
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml	Teknokroma	TR-F034000
Autosampler Vials	Klaus Trott Chromatographie-Zubehör	40 11 01 740
Acclaim PepMap 100 C18 LC Column	Thermo Fischer Scientific	164534
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph	Thermo Fischer Scientific	LC120
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Fischer Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
Acquity UPLC system	Waters	Custom order
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg	Waters	186003533
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions	Bandelin	RK 31
Genedata Expressionist	Genedata	NaN
Xcalibur Software	Thermo Fischer Scientific	NaN
MaxQuant	NaN	NaN