Méthodologie pour une détection précise de la méthylation de l’ADN Mitochondrial
Summary
Nous présentons ici un protocole pour permettre une quantification précise de la méthylation de l’ADN (ADN mitochondrial) mitochondriale. Dans ce protocole, nous décrivons une digestion enzymatique de l’ADN avec BamHI couplé avec un pipeline d’analyse bio-informatique qui peut être utilisé pour éviter une surestimation des niveaux de méthylation de l’ADNmt causée par la structure secondaire de l’ADNmt.
Abstract
Quantification de la méthylation de l’ADN peut être réalisée en utilisant le séquençage de bisulfite, qui tire parti de la propriété de bisulfite de sodium pour convertir non méthylé cytosine en uracile, dans un contexte d’ADN simple brin. Le séquençage du bisulfite peut être ciblée (par PCR) ou effectuée sur l’ensemble du génome et fournit une quantification absolue de la méthylation de la cytosine à la résolution de base unique. Compte tenu de la nature distincte de l’ADN nucléaire et mitochondrial, notamment dans la structure secondaire, adaptations des méthodes de séquençage de bisulfite pour étudier la méthylation de la cytosine dans l’ADN mitochondrial se référera. Structure secondaire et tertiaire de l’ADNmt peut en effet conduire à bisulfite de séquençage des artefacts conduisant à des faux positifs en raison de la piètre accès incomplet dénaturation de bisulfite à l’ADN simple brin. Nous décrivons ici un protocole utilisant une digestion enzymatique de l’ADN avec BamHI couplé avec pipeline analyse bioinformatique pour permettre une quantification précise de la cytosine niveaux de méthylation de l’ADN mitochondrial. En outre, nous fournissons des lignes directrices pour concevoir les amorces de séquençage de bisulfite spécifiques d’ADN mitochondrial, afin d’éviter de cibler les segments nucléaire MiTochondrial indésirables (NUMTs) inséré dans le génome nucléaire.
Introduction
Le génome mitochondrial est une structure circulaire double brin de base environ 16,5 kilos (Ko), constituant un lourd et un brin de lumière. Le génome mitochondrial est présent en plusieurs exemplaires dans chaque cellule, maternellement hérité et encode les éléments essentiels de la chaîne respiratoire des complexes1. Semblables aux génomes bactériens et à la différence du génome nucléaire, le génome mitochondrial est organisé dans nombreuses structures secondaires et tertiaires, comme structures enroulé et surenroulé2, qui peuvent rendre l’accès difficile pendant le séquencement expériences,3.
Dans le noyau, la méthylation de l’ADN est une marque épigénétique étudiée qui joue un rôle dans de nombreux processus, notamment dans la régulation de l’expression des gènes. Dans les génomes de mammifères, la méthylation de l’ADN se produit principalement sur la position de l’anneau de pyrimidine de deoxycytidines, pour la plupart sur des dinucléotides CG (ou CpG) 5. Méthylation de la cytosine se trouve à 70 % de tous les CpG dans le génome des cellules somatiques et représente environ 1 % du total que des bases de l’ADN4. Méthylations de l’ADN ont également été recensés dans des contextes non-CpG, tels que le CpA, CpT et CpC et existent en différentes quantités dans l’ADN nucléaire, avec des valeurs jusqu’à 25 % de tous les cytosines méthylées dans les cellules souches embryonnaires5,6,7.
Alors que la méthylation de la cytosine du génome nucléaire est largement acceptée, l’existence de méthylation de l’ADN (ADN mitochondrial) mitochondriale est encore controversée. La première étude d’instruction ADNmt méthylation a été réalisée dans des cellules cultivées où la méthylation de l’ADN mitochondrial a été facilement détectée, mais à des niveaux inférieurs par rapport à l’ADN nucléaire8. Dans les cellules humaines et murines, méthylation de l’ADN mitochondrial a été également détectée à faibles doses (2-5 %). À l’aide d’essais en s’appuyant sur 5 méthylcytosine capture comme immunoprécipitation d’ADN méthylée (MeDIP) suivie d’une PCR quantitative, méthylation de l’ADN mitochondrial a aussi détectée dans diverses souris et les humains et les cellules lignes9,10, 11,,12. Utilisant des anticorps contre la 5-méthylcytosine dans une analyse ELISA ou spectrométrie de masse, des niveaux importants de méthylation de l’ADN ont été détectés des fractions mitochondriales purifiée13,14,15, 16. Toutefois, la plupart des essais dans les études susmentionnées a utilisé des techniques qui ne visaient pas à procurer une quantification absolue de méthylation de l’ADN à la résolution de base unique.
Analyse quantitative et résolutoire méthylation d’ADN peut être réalisée par une technique nommée « bisulfite de séquençage », qui tire parti de la propriété de bisulfite de sodium pour convertir non méthylé cytosine en uracile en simple brin ADN contexte17 . Moyen du séquençage de bisulfite, une constellation d’études a détecté la présence de la méthylation de la cytosine à différents niveaux. Méthylation de l’ADN mitochondrial dans la région de la boucle D, de la 12 s ou de la région de 16 s était facilement détectable à l’humain18,19,20,21,22,23 et souris24 tissus et cellules, cependant, avec une variabilité intrigante, de 1 à 20 % du totales cytosines dans toutes les études.
En comparaison avec ces nombreuses études, seules quelques études, y compris de notre groupe, ont contesté la présence de l’ADN mitochondrial méthylation3,25,26,27 ou conteste la pertinence biologique de niveaux très faibles d’ADNmt niveaux (inférieur à 2 %)28. Récemment, nous avons rapporté l’observation d’un artefact de bisulfite de séquençage potentiel au bisulfite ensemble mitochondrial séquençage3. On a démontré que la structure secondaire de l’ADN mitochondrial pourrait conduire à de faux positifs dans le séquençage de bisulfite, surestimant ainsi des niveaux de méthylation. Nous fournissons ici un protocole visant à prévenir un artefact de bisulfite de conversion de l’ADNmt. Ce protocole utilise une simple digestion enzymatique de l’ADN afin de perturber les structures secondaires de l’ADNmt et autorise l’accès complet au bisulfite selon un protocole de séquençage de bisulfite. En outre, nous fournissons un accompagnement pipeline bioinformatiques pour l’analyse du séquençage de bisulfite.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous fournissons un protocole de bisulfite de séquençage qui est spécifiquement conçu pour interroger la méthylation de l’ADN mitochondrial. Les différences avec le bisulfite de séquençage protocoles utilisés pour l’ADN génomique réside dans l’utilisation d’une étape de digestion préalable des enzymes de restriction et une analyse bioinformatique arrêt des faux positifs découlant de séquences NUMT.
Nous fournissons un protocole pour éviter les artefacts de bisulfi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Novo Nordisk Foundation Centre for Basic Research métabolique est un centre de recherche indépendant à l’Université de Copenhague, partiellement financé par un don sans restriction de la Novo Nordisk Foundation.
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
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