Metodologia per la rilevazione accurata di metilazione del DNA mitocondriale
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per consentire la quantificazione accurata della metilazione del DNA (mtDNA) mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con una pipeline di analisi bioinformatica che può essere utilizzata per evitare la sopravvalutazione dei livelli di metilazione del DNA mitocondriale causato dalla struttura secondaria del mtDNA.
Abstract
Quantificazione di metilazione del DNA può essere ottenuto utilizzando del bisolfuro, che sfrutta la proprietà di bisolfito di sodio per convertire unmethylated citosina in uracile, in un contesto di DNA single-stranded. Del bisolfuro può essere mirato (mediante PCR) o eseguite sul genoma intero e fornisce quantificazione assoluta di metilazione della citosina alla singola base-risoluzione. Data la natura distinta del DNA nucleare e mitocondriale, in particolare nella struttura secondaria, adattamenti di metodi di sequenziamento di bisolfito per indagare la metilazione della citosina nel mtDNA dovrebbero essere fatto. Struttura secondaria e terziaria di mtDNA può effettivamente portare ad bisolfito sequenziamento artefatti che conduce a falsi positivi a causa di scarso accesso denaturazione incompleta di bisolfito a DNA single-stranded. Qui, descriviamo un protocollo con una digestione enzimatica del DNA con BamHI accoppiato con pipeline di analisi bioinformatica per consentire la quantificazione accurata della citosina i livelli di metilazione nel mtDNA. Inoltre, forniamo le linee guida per la progettazione il primer di sequenziamento di bisolfito specifici di mtDNA, al fine di evitare indesiderabili segmenti nucleare mitocondriale di targeting (NUMTs) inserito nel genoma nucleare.
Introduction
Il genoma mitocondriale è una struttura circolare, doppio filamento di circa 16,5 kg base (kb), che costituiscono un pesante e un filo di luce. Il genoma mitocondriale è presente in più copie all’interno di ogni cella, maternamente ereditata e codifica componenti essenziali della catena respiratoria complessi1. Simili ai genomi batterici e a differenza di genoma nucleare, il genoma mitocondriale è organizzato in numerose strutture secondarie e terziarie, come strutture a spirale e supercoiled2, che può rendere difficile l’accesso durante la sequenza esperimenti3.
Nel nucleo, metilazione del DNA è un contrassegno epigenetico estesamente studiato che svolge un ruolo in numerosi processi, in particolare nella regolazione dell’espressione genica. Nel genoma di mammiferi, metilazione del DNA avviene principalmente sulla posizione 5 dell’anello pirimidinico di deoxycytidines, per lo più su dinucleotidi CG (o CpG). Metilazione della citosina è trovata al 70% di tutti i CpG nel genoma di cellule somatiche e conti per ~ 1% del totaleche 4basi di DNA. Iperomocisteinemici del DNA è stata descritta anche in contesti non-CpG, come CpA, CpT e CpC ed esiste in varie quantità nel DNA nucleare, con valori fino al 25% di tutti i cytosines metilati in cellule staminali embrionali5,6,7.
Mentre la metilazione della citosina del genoma nucleare è ampiamente accettata, l’esistenza di metilazione del DNA (mtDNA) mitocondriale è ancora discutibile. Il primo studio investigativo del mtDNA metilazione è stata eseguita in cellule coltivate dove la metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata prontamente, anche se a livelli inferiori rispetto al nucleare DNA8. Nelle cellule umane e murine, metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata anche a livelli bassi (2-5%). Usando le analisi basandosi su 5 metilcitosina cattura quali immunoprecipitazione di DNA metilato (MeDIP) seguita da PCR quantitativa, metilazione del DNA mitocondriale è stata rilevata anche in vari mouse e umani e cellule linee9,10, 11,12. Usando gli anticorpi contro la 5-metilcitosina in un test ELISA o spettrometria di massa, notevoli livelli di metilazione del DNA sono stati rilevati dalle frazioni mitocondriali purificate13,14,15, 16. Tuttavia, la maggior parte dei saggi negli studi suddetti usato tecniche che non sono stati progettati per fornire una quantificazione assoluta di metilazione del DNA a singola base-risoluzione.
Analisi di metilazione del DNA quantitativa e risolutiva può avvenire mediante una tecnica denominata “bisolfito di sequenziamento”, che si avvale della proprietà di bisolfito di sodio per convertire unmethylated citosina in uracile nel DNA single-stranded contesto17 . Utilizzo del bisolfuro, una costellazione di studi ha rilevato la presenza di metilazione della citosina a vari livelli. MtDNA di metilazione della regione D-loop, il 12S o della regione 16S è stato rilevato prontamente in umano18,19,20,21,22,mouse e23 24 tessuti e cellule, tuttavia, con una variabilità intrigante, 1-20% del totale cytosines attraverso gli studi.
In confronto a questi numerosi studi, solo pochi studi, tra cui dal nostro gruppo, hanno contestato la presenza del mtDNA metilazione3,25,26,27 o messo in discussione la rilevanza biologica di livelli molto bassi di mtDNA livelli (inferiore al 2%)28. Recentemente, abbiamo segnalato l’osservazione di un artefatto del bisolfuro potenziale nel complesso mitocondriale bisolfito sequenziamento3. Abbiamo fornito la prova che la struttura secondaria del DNA mitocondriale potrebbe portare a falsi positivi in bisolfuro, sopravvalutando quindi i livelli di metilazione. Qui forniamo un protocollo per prevenire un artefatto del bisolfito-conversione del mtDNA. Questo protocollo utilizza una semplice digestione enzimatica del DNA di distruggere strutture secondarie del mtDNA e consentire l’accesso completo al bisolfito seguendo un protocollo di sequenziamento di bisolfito. Inoltre, forniamo un’accompagnamento pipeline di bioinformatica per l’analisi di bisolfuro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, forniamo un protocollo del bisolfuro che è specificamente progettato per interrogare la metilazione del DNA mitocondriale. Le differenze con del bisolfuro protocolli utilizzati per DNA genomico si trova nell’utilizzazione di una fase di digestione degli enzimi di limitazione preventiva e un’analisi bioinformatica sentenza fuori falsi positivi derivanti da sequenze di NUMT.
Forniamo un protocollo per evitare artefatti del bisolfuro durante l’analisi di metilazione del DNA mitocondriale. M…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Novo Nordisk Fondazione Centro per la ricerca di base metabolica è un centro indipendente di ricerca presso l’Università di Copenaghen, parzialmente finanziato da una donazione senza restrizione della Fondazione di Novo Nordisk.
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
Referências
- Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D’Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down’s syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -. M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. . Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. The BiSearch web server. BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
