Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um genaue Quantifizierung der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung. In diesem Protokoll beschreiben wir eine enzymatische Verdauung von DNA mit BamHI gepaart mit einem bioinformatische Analyse Pipeline die Überschätzung der MtDNA Methylierung Ebenen verursacht durch die Sekundärstruktur des MtDNA zu vermeiden verwendet werden können.
Abstract
Quantifizierung der DNA-Methylierung kann erreicht werden mit Bisulfit-Sequenzierung, die Vorteile des Eigentums von Natrium Bisulfit unmethylated Cytosin in Uracil in einem einzelsträngigen DNA-Kontext zu konvertieren. Bisulfit-Sequenzierung können gezielt (mittels PCR) oder auf das gesamte Genom durchgeführt und bietet absolute Quantifizierung von Cytosin Methylierung in der einzigen Basis-Auflösung. Angesichts der deutlichen der nuklearen und mitochondriale DNA, vor allem in der Sekundärstruktur, sollten Anpassungen von Bisulfit Sequenzierung Methoden für die Untersuchung von Cytosin Methylierung in MtDNA erfolgen. Sekundäre und tertiäre Struktur der MtDNA führt in der Tat zu Bisulfit Artefakte zu Fehlalarme aufgrund von unvollständigen Denaturierung schlechte Anbindung von Bisulfit einzelsträngigen DNA-Sequenzierung. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einer enzymatischen Verdauung der DNA mit BamHI gepaart mit bioinformatische Analyse Pipeline ermöglichen genaue Quantifizierung von Cytosin Methylierung Ebenen in MtDNA. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien für die Gestaltung von Bisulfit Sequenzierung Primer spezifisch für MtDNA, zur Vermeidung von unerwünschten nuklearen mitochondriale Segmente gezielt (NUMTs) in das Kerngenom eingesetzt.
Introduction
Das mitochondriale Genom ist eine kreisförmige, doppelsträngige Struktur von rund 16,5 Kilo Base (kb) lang, bilden eine schwere und eine leichte Faser. Das mitochondriale Genom ist in mehrere Kopien in jeder Zelle, mütterlich vererbt, und wesentliche Bestandteile der Atmungskette komplexe1kodiert. Ähnlich wie bei bakteriellen Genome und anders als das Kerngenom, des mitochondrialen Genoms in zahlreichen sekundären und tertiären Strukturen, wie z. B. gewickelten und supercoiled Strukturen2, gliedert sich in die Zugang schwierig, während der Sequenzierung machen können Experimente-3.
Im Zellkern ist Methylierung der DNA ein ausgiebig studierte epigenetische Markierung, die in zahlreiche Prozesse, vor allem in der Regulation der Genexpression eine Rolle spielt. In Säugetier-Genome tritt DNA-Methylierung in erster Linie auf der 5-Position der Pyrimidine Ring der Deoxycytidines, meistens auf CG dinucleotid (oder CpG). Cytosin Methylierung findet sich bei 70 % von allen CpG im Erbgut von Körperzellen und Konten für ~ 1 % der gesamten DNA4Basen. DNA-Methylations ist auch in nicht-CpG zusammenhängen, wie CpA, CpT und CpC beschrieben worden und existieren in verschiedenen Mengen in Kern-DNA, mit Werten bis zu 25 % von allen methylierte Cytosines in embryonale Stammzellen5,6,7.
Während Cytosin Methylierung von das Kerngenom weithin anerkannt ist, ist die Existenz der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung noch umstritten. Die erste Studie untersucht MtDNA Methylierung erfolgte in kultivierten Zellen wo MtDNA Methylierung bereitwillig erkannt wurde, obwohl auf einem niedrigeren Niveau im Vergleich zu nuklearen DNA-8. In menschlichen und murinen Zellen wurde MtDNA Methylierung auch auf einem niedrigen Niveau (2-5 %) festgestellt. Mit Berufung auf 5 Methylcytosine erfassen wie METHYLIERTE DNA Immunopräzipitation (MeDIP) gefolgt von quantitativen PCR Assays, MtDNA Methylierung wurde auch in verschiedenen Maus und Mensch erkannt und Zellen Linien9,10, 11,12. Mit Antikörpern gegen 5 Methylcytosine in einem ELISA-Test oder Massenspektrometrie, waren wesentliche Ebenen der DNA-Methylierung von gereinigten mitochondriale Fraktionen13,14,15, erkannt. 16. jedoch der Großteil der Assays in den genannten Studien verwendet Techniken, die nicht entworfen waren, um absolute Quantifizierung der DNA-Methylierung in der einzigen Basis-Auflösung bieten.
Quantitative und auflösenden DNA-Methylierung Analyse durch eine Technik namens “Bisulfit Sequenzierung”, lässt sich die Vorteile des Eigentums von Natrium Bisulfit unmethylated Cytosin in Uracil in einzelsträngiger DNA Kontext17 konvertieren . Eine Konstellation von Studien erkannt mit Bisulfit-Sequenzierung, die Anwesenheit von Cytosin Methylierung auf verschiedenen Ebenen. Im menschlichen18,19,20,21,22,23 und Maus24 wurde bereitwillig Methylierung MtDNA in der D-Loop-Region, der 12 s oder 16 s Region erkannt. Geweben und Zellen, jedoch mit einer faszinierenden Variabilität, von 1-20 % des gesamten Cytosines in Studien.
Im Vergleich zu diesen zahlreichen Studien haben nur wenige Studien, unter anderem von unserer Fraktion bestritten die Anwesenheit von MtDNA Methylierung3,25,26,27 oder in Frage gestellt die biologische Relevanz der sehr niedrige Niveaus von MtDNA (unter 2 %)28. Vor kurzem berichteten wir die Beobachtung eines potenziellen Bisulfit-Sequenzierung Artefakts in ganzen mitochondriale Bisulfit Sequenzierung3. Wir haben nachgewiesen, die die Sekundärstruktur der mitochondrialen DNA zu Fehlalarmen in Bisulfit-Sequenzierung, könnte damit überschätzen Methylierung Ebenen. Wir bieten hier ein Protokoll um ein Artefakt der Bisulfit-Umwandlung von MtDNA zu verhindern. Dieses Protokoll verwendet eine einfache enzymatische Verdauung von DNA zu stören MtDNA Sekundärstrukturen und vollen Zugriff auf Bisulfit nach einem Bisulfit-Sequenzierung-Protokolls zu ermöglichen. Darüber hinaus bieten wir eine begleitende Bioinformatik-Pipeline für die Analyse von Bisulfit-Sequenzierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier bieten wir ein Bisulfit-Sequenzierung-Protokoll, das speziell für die MtDNA-Methylierung zu befragen. Die Unterschiede mit Bisulfit-Sequenzierung Protokolle für genomische DNA liegt bei der Verwertung von eine vorherige Beschränkung Enzym Verdauung Schritt und eine bioinformatische Analyse Urteil, falsche positive aus NUMT Sequenzen.
Wir bieten ein Protokoll zur Bisulfit-Sequenzierung Artefakte zu vermeiden, bei der Untersuchung von MtDNA-Methylierung. Bisulfit Sequenzierung Artefakte …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Novo Nordisk Stiftungszentrum für metabolische Grundlagenforschung ist ein unabhängiges Forschungsinstitut an der Universität Kopenhagen, teilweise durch eine freie Spende von Novo Nordisk Stiftung finanziert.
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
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