Методология для точного обнаружения метилирования митохондриальной ДНК
Summary
Здесь мы представляем протокол, чтобы точная количественная оценка митохондриальной ДНК (мтДНК) метилирование. В этом протоколе мы описываем ферментативного пищеварения ДНК с BamHI в сочетании с bioinformatic анализа трубопровода, который может использоваться для избежания переоценки мтДНК метилирования уровней, вызванные вторичную структуру мтДНК.
Abstract
Количественная оценка метилирование ДНК можно добиться, используя бисульфита последовательности, которая использует свойство бисульфит натрия для преобразования unmethylated цитозина в урацил, в контексте одноцепочечной ДНК. Гидросульфит последовательности могут быть направлены (с помощью ПЦР) или на весь геном и обеспечивает абсолютное количественная оценка метилирование цитозина в одной базой резолюцию. Учитывая особый характер ядерной – и митохондриальной ДНК, особенно в вторичной структуре, следует адаптации методов секвенирования бисульфита для расследования метилирование цитозина в митохондриальной ДНК. Вторичной и третичной структуры митохондриальной ДНК может действительно привести к бисульфита, секвенирование артефакты, ведущих к ложных срабатываний из-за неполной денатурации плохой доступ бисульфита одноцепочечной ДНК. Здесь мы описываем протокол, с помощью ферментативного пищеварения ДНК с BamHI в сочетании с конвейера bioinformatic анализ позволяет точную количественную оценку цитозина уровень метилирования в митохондриальной ДНК. Кроме того мы предоставляем руководства для проектирования бисульфита последовательности Праймеры для митохондриальной ДНК, во избежание ориентации нежелательных ядерной митохондриальной сегментов (NUMTs) вставляется в ядерный геном.
Introduction
Митохондриального генома — это циркулярный, двунитевая структура приблизительно 16,5 кило base (КБ) долго, составляющих из тяжелых и легких strand. Митохондриального генома присутствует в нескольких копий внутри каждой клетки, матерински унаследовал и кодирует важные компоненты дыхательной цепи комплексы1. Аналогичные, бактериальных геномов и в отличие от ядерного генома, митохондриального генома организована в многочисленных вторичной и третичной структуры, такие как спиральный и supercoiled структур2, который может затруднить доступ во время виртуализации 3эксперименты.
В ядре метилирование ДНК является широко изучены эпигеномные Марк, который играет роль в многочисленных процессах, особенно в регуляции экспрессии генов. В млекопитающих геномов метилирование ДНК происходит главным образом на положении 5 пиримидина кольцо deoxycytidines, главным образом на CG dinucleotides (или CpG). Метилирование цитозина находится на 70% всех ВПУ в геном соматических клеток и составляет ~ 1% от общего числа ДНК баз4. Methylations ДНК также был описан в не CpG контекстах, например, КПД, КПП и КПК и существуют в различных количествах в ядерной ДНК, значениями до 25% всех метилированные cytosines в эмбриональных стволовых клеток5,6,7.
Хотя широко признается, метилирование цитозина ядерного генома, существование митохондриальной ДНК (мтДНК) метилирование остается спорным. Первое исследование следственный мтДНК метилирования была исполнена в культивируемых клеток, где легко обнаружен мтДНК метилирования, хотя на более низких уровнях, по сравнению с ядерной ДНК8. В клетках человека и мышиных метилирование митохондриальной ДНК был также обнаружен при низких уровнях (2-5%). С помощью анализов, полагаясь на 5 обнаружен захвата таких метилированной ДНК иммунопреципитации (МЕДИП) следуют количественного PCR, метилирование митохондриальной ДНК был также обнаружен в различных человека и мыши и клеток линии9,10, 11,12. Использование антител против 5-метилцитозин анализа ELISA или масс-спектрометрии, значительный уровень метилирования дна были обнаружены из очищенного митохондриальной фракций13,14,15, 16. Однако большинство анализов в рамках вышеупомянутых исследований используются методы, которые не были предназначены для обеспечения абсолютной количественная оценка метилирование ДНК в одной базой резолюцию.
Анализ метилирования ДНК количественные и резолютивной может быть достигнуто путем метод под названием «Гидросульфит виртуализации», которая использует свойство бисульфит натрия для преобразования unmethylated цитозина в урацила в одноцепочечной ДНК контекст17 . С помощью последовательности бисульфита, созвездие исследований было обнаружено присутствие метилирование цитозина на различных уровнях. Метилирование мтДНК в регионе D-петля, 12С или регионе 16S легко был обнаружен в человека18,19,20,21,,2223 и мыши24 тканей и клеток, однако, с интригующим изменчивости, 1-20% от общего cytosines различных исследований.
По сравнению с эти многочисленные исследования только несколько исследований, в том числе из нашей группы, оспаривает наличие мтДНК метилирования3,25,,2627 или сомнение биологической значимости очень низкий уровень мтДНК уровней (ниже 2%)28. Недавно мы сообщили наблюдения потенциальным бисульфит последовательности артефакт в целом митохондриальной бисульфита последовательность3. Мы предоставили доказательства того, что вторичная структура митохондриальной ДНК может привести к ложных срабатываний в бисульфит последовательности, тем самым переоценивать уровень метилирования. Здесь мы предоставляем протокол для предотвращения артефакт бисульфит-преобразования митохондриальной ДНК. Этот протокол использует простой ферментативного пищеварения ДНК нарушить мтДНК вторичных структур и разрешить полный доступ к бисульфита после бисульфита последовательность протокола. Кроме того мы предоставляем сопутствующие bioinformatic трубопровода для анализа бисульфита последовательности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставляем бисульфит последовательность протокола, который специально предназначен для допросить мтДНК метилирования. Различия с бисульфит последовательность протоколов, используемых для геномной ДНК лежит в использования предварительного энзима ограничения шаг пищев…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Основные метаболические научно-исследовательский центр Фонда Ново Нордиск является независимый исследовательский центр в университете Копенгагена, частично финансируется неограниченного пожертвование от Фонда Ново Нордиск.
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
Referências
- Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D’Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down’s syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -. M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. . Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. The BiSearch web server. BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
