Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para permitir que a quantificação exata de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com um pipeline de análise de bioinformatic que pode ser usado para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial causada pela estrutura secundária do DNA mitocondrial.
Abstract
Quantificação de metilação do DNA pode ser conseguida usando sequenciamento de bissulfito, que aproveita a propriedade de bissulfito de sódio para converter unmethylated citosina em uracil, num contexto single-stranded DNA. Sequenciamento de bissulfito pode ser direcionado (usando PCR) ou executadas no genoma inteiro e fornece quantificação absoluta de metilação de citosina na única base-resolução. Dada a natureza distinta de DNA nuclear e mitocondrial, nomeadamente a estrutura secundária, devem ser feitas adaptações de métodos de sequenciamento de bissulfito para investigar a metilação de citosina no DNA mitocondrial. Estrutura secundária e terciária de DNA mitocondrial de fato pode levar a bissulfito artefatos levando a falso-positivos devido a acesso de pobres incompleta desnaturação de bissulfito de ADN single-stranded de sequenciamento. Aqui, descrevemos um protocolo usando uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com pipeline de análise de bioinformatic para permitir a quantificação exata da citosina níveis de metilação no DNA mitocondrial. Além disso, podemos fornecer diretrizes para projetar os primers de sequenciamento de bissulfito específicos para DNA mitocondrial, para evitar a segmentação segmentos NUclear mitocondrial indesejáveis (NUMTs) inserido no genoma nuclear.
Introduction
O genoma mitocondrial é uma estrutura circular, double-stranded de aproximadamente 16,5 kg base (kb), constitui um pesado e um fio de luz. O genoma mitocondrial está presente em várias cópias dentro de cada célula, herdado maternalmente e codifica componentes essenciais da cadeia respiratória complexos1. Semelhantes aos genomas bacterianas e ao contrário do genoma nuclear, o genoma mitocondrial é organizado em numerosas estruturas secundárias e terciárias, como em estruturas enrolado e supercoiled2, que pode tornar o acesso difícil durante o sequenciamento experiências3.
No núcleo, metilação do DNA é uma marca epigenética extensivamente estudada que desempenha um papel em vários processos, nomeadamente na regulação da expressão gênica. Em genomas de mamíferos, a metilação do DNA ocorre principalmente na posição 5 do anel pirimidina de deoxycytidines, principalmente de dinucleotídeos CG (ou CpG). Metilação de citosina é encontrada em 70% de todos os CpG no genoma de células somáticas e contas para ~ 1% do totalque 4bases de DNA. Methylations de DNA também tem sido descrita em contextos não-CpG, como CpA, CpT e CpC e existem em várias quantidades no DNA nuclear, com valores até 25% de todas as Citosinas metiladas em células-tronco embrionárias5,6,7.
Enquanto o methylation do cytosine do genoma nuclear é amplamente aceito, a existência de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial é ainda controversa. O primeiro estudo investigar methylation DNA mitocondrial foi realizado em pilhas cultivadas onde a metilação do DNA mitocondrial foi prontamente detectada, embora em níveis mais baixos em comparação com nuclear DNA8. Em células humanas e murino, metilação de DNA mitocondrial também foi detectada em níveis baixos (2-5%). Utilizando ensaios contando com 5 metilcitosina captura, tais como imunoprecipitação de DNA metilada (MeDIP) seguida por PCR quantitativo, metilação de DNA mitocondrial também foi detectada em vários rato e humanos e células linhas9,10, 11,12. Usando anticorpos contra 5-metilcitosina em um ensaio de ELISA ou espectrometria de massa, níveis substanciais de metilação do DNA foram detectados purificada fracções mitocondrial13,14,15, 16. no entanto, a maioria dos ensaios nos estudos acima mencionados utilizado técnicas que não foram projetadas para fornecer a quantificação absoluta de metilação do DNA na única base-resolução.
Análise de metilação de DNA quantitativo e resolutiva pode ser alcançado por uma técnica chamada “bissulfito de sequenciamento”, que aproveita a propriedade de bissulfito de sódio para converter unmethylated citosina em uracil em single-stranded DNA contexto17 . Usando o sequenciamento de bissulfito, uma constelação de estudos detectou a presença de metilação de citosina em vários níveis. DNA mitocondrial de metilação na região D-loop, a 12S ou região 16S prontamente foi detectado em humano18,19,20,21,22,mouse de23 e24 tecidos e células, no entanto, com uma variabilidade de intrigante, de 1-20% do totais citosinas através de estudos.
Em comparação com estes numerosos estudos, poucos estudos, incluindo do nosso grupo, têm disputado a presença de DNA mitocondrial metilação3,25,26,27 ou questionado a relevância biológica de níveis muito baixos de mtDNA níveis (abaixo de 2%)28. Recentemente, nós relatamos a observação de um artefato de bissulfito-sequenciamento potencial em toda mitocondrial bissulfito sequenciamento3. Nós fornecemos evidências de que a estrutura secundária do DNA mitocondrial pode levar a resultados falsos positivos sequenciamento de bissulfito, desse modo, superestimando os níveis de metilação. Nós fornecemos aqui um protocolo para evitar um artefato de bissulfito-conversão de DNA mitocondrial. Este protocolo utiliza uma simples digestão enzimática do DNA para interromper estruturas secundárias do DNA mitocondrial e permitir o acesso total ao bissulfito, seguindo um protocolo de sequenciamento de bissulfito. Além disso, nós fornecemos um pipeline de bioinformatic acompanhamento para a análise do sequenciamento de bissulfito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós fornecemos um protocolo de bissulfito-sequenciamento que é projetado especificamente para interrogar a metilação do DNA mitocondrial. As diferenças com bissulfito-sequenciamento protocolos usados para DNA genômico situa-se na utilização de uma enzima de restrição prévia etapa de digestão e uma análise de bioinformatic acórdão fora falsos positivos decorrentes NUMT sequências.
Nós fornecemos um protocolo para evitar artefatos de bissulfito-sequenciamento ao investigar…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A Novo Nordisk Fundação Centro de pesquisa metabólica básica é um centro de pesquisa independente da Universidade de Copenhagen, parcialmente financiados por uma doação irrestrita da Novo Nordisk Foundation.
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
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