Summary
כאן נתאר בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד כדי להעריך את החיסון פנוטיפי ו פונקציונלי (ציטוקינים תאיים אינדוקציה) שינויים בדגימות דם היקפיים, נותחו באמצעות cytometry המוני.
Abstract
ציטוקינים לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות. לפיכך, מדידת רמות ציטוקינים כבר המוקד של מחקרים רבים בניסיון להבין את המנגנונים מדויק להוביל להתמוטטות של self-tolerance ושל הבאים מחלת חיסון עצמי. הגישות כה התבססו על המחקר של היבט מסוים אחד של המערכת החיסונית (יחיד או מספר סוגי תאים או ציטוקינים), ואת לא מציעים הערכה גלובלית של מחלה אוטואימונית מורכבת. בעוד מחקרים מבוססי סרה החולה היה להרשות לעצמו תובנות חשובות מחלת חיסון עצמי, הם אינם מספקים מקור סלולרית מסוימת ציטוקינים dysregulated זוהה. גישה בתא יחיד כוללת כדי להעריך את ייצור ציטוקינים קבוצות משנה מרובות תאים חיסוניים, בהקשר של "מהותי" פלזמה החולה הספציפי במחזור גורמים, מתואר כאן. גישה זו מאפשרת ניטור של פנוטיפ המערכת החיסונית החולה הספציפי (סמני פני השטח) פונקציה (ציטוקינים), או מקורי שלו "מהותי פתוגניים" מחלת המדינה, או הנוכחות של סוכני טיפולית (vivo בתוך או ex-vivo).
Introduction
מחלות אוטואימוניות הן הגורם העיקרי התחלואה והתמותה המשפיעים על 3-8% מכלל האוכלוסייה. בארצות הברית, הפרעות אוטואימוניות הם בין הגורמים המובילים. למוות אצל נשים בגיל העמידה, צעיר (גילאי < 65 שנה)1,2. הפרעות אוטואימוניות מאופיינים מצגת הטרוגניות קלינית ותהליכים אימונולוגי כבסיס מגוונות. הספקטרום של הטרוגניות מיוצגת היטב על פני הפרעות שונות, כגון משותפת במעורבות דלקת מפרקים שגרונית (RA), מחלה נוירולוגית ב טרשת נפוצה (MS). עם זאת, רמה זו של הטרוגניות היא גם ביטוי תוך הפרעה יחיד, כגון זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן): חלק מהחולים יכול להציג עם הפתולוגיה הכליה, בעוד שאחרים סובלים מעורבות המטולוגיות או משותפת3.
השיגה הבסיסית הפרעות אוטואימוניות שיקוף של הטרוגניות קלינית, מעורבים, hyper-הפעלה אוטומטית של מספר קבוצות משנה תא החיסון מולדים, גמישים, וייצור dysregulated והמצוות ציטוקין. ואילו ציטוקינים לשחק תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מחלת חיסון עצמי, הבנת תפקידם ספציפית את המנגנון של מחלת הוכיחה להיות מאתגרת. ציטוקינים מאופיינים פליאוטרופיה (ציטוקין אחד יכול להיות אפקטים מרובים על סוגי תאים שונים), יתירות (ציטוקינים מרובים יכול להיות אפקט זהה), דואליות (ציטוקין אחד יכול להיות פרו - או אנטי - inflammatory תופעות בתנאים שונים), הפלסטיות (ציטוקינים יכול להיות יצוק לתוך תפקיד שונה מכל אחד "מקורי", בהתאם לסביבת)4,5,6. כתוצאה מכך, האוכלוסיה ברמת שיטות מבדילה הטרוגנית הסלולר התגובות לאותו "ציטוקין סביבה". באופן דומה, לומדים עיצובים להתמקד בהיבט מסוים אחד של המערכת החיסונית (סוג של תא בודד או ציטוקינים), לא מציעים הערכה גלובלית של כל הגורמים המעורבים מחלות אוטואימוניות מורכבות. בעוד מחקרים מבוססי סרה החולה היה להרשות לעצמו תובנות חשובות מחלת חיסון עצמי, הם אינם מספקים מקור סלולרית מסוימת ציטוקינים dysregulated זוהה.
לאחרונה פיתחנו בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד בו זמנית להעריך מספר סוגי תאים חיסוניים, לזהות חצרו של המטופל הספציפי "פתוגניים" פלזמה דם היקפיים במחזור גורמים לפליטת ציטוקינים שונים שלהם. זרימת העבודה המתוארת כאן מאופיין על ידי השימוש של דגימות דם היקפיים ללא פגע, לעומת תאי תאי דם היקפיים מבודד (PBMCs). דם היקפיים מייצג את הרכב הרלוונטיים ביותר מבחינה פיזיולוגית ללמוד מחלה מערכתית בתיווך החיסון, כולל 1) הלא-תאי תאי דם לעיתים קרובות מעורבים מחלות אוטואימוניות (קרי, נויטרופילים, טסיות דם), ו 2) פלזמה במחזור גורמים, כגון חומצות גרעין, מכלולים חיסוניים ציטוקינים, אשר יש תפקידים הפעלת מערכת החיסון. כדי ללכוד "מהותי פתוגניים" dysregulated ייצור ציטוקינים, דם היקפיים דגימות יעובדו מיד לאחר ההגרלה דם (T0, זמן אפס), ואחרי 6-אייץ ' של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס (חום הגוף פיזיולוגיים) עם טרנספורט חלבון מעכב, בהעדר כל אקסוגניים מגרה תנאי (T6, הזמן 6 h), כדי לזהות ייצור ציטוקינים (הצטברות, T6-T0) המשקפים את מצב המחלה "מהותי" (איור 1). ללמוד תהליכים dysregulated המשקפים מעל או מתחת הפעלת איתות המעורבים בתגובות החיסון הרלוונטיים למחלה, בדגימת דם היקפיים שטופלו (6-אייץ ' הדגירה ב 37 ° C עם מעכב תחבורה חלבון) אקסוגני עירור מצב זה משקף בפתוגנזה של המחלה, כגון אגרה-כמו-קולטן (TLR) אגוניסטים במקרה של מירה כהן (T6 + R848, הזמן 6 h עם µg 1/mL R848), כדי לזהות ייצור ציטוקינים שתשקף בתגובה חומצות גרעין (השוואת T0 לעומת T6 לעומת T6 + R848, איור 1). ללמוד immunomodulatory ההשפעות של הרפוי זמין ex-vivo, ובארכיון לתהליכים מדויקים dysregulated המערכת החיסונית לחולים ספציפיים, דגימות דם היקפיים שטופלו JAK מעכב-הרלוונטי טיפולית ריכוז (כאן, 5 אום ruxolitinib; T6 + 5R, זמן 6 שעות עם 5 אום ruxolitinib), כדי לזהות שינויים במצב המחלה "מהותי", בתגובה התרופה (T0 לעומת T6 לעומת T6 + 5R, איור 1). מעכב JAK נבחר במחקר זה כיוון JAK מעכבי הוכחו להיות מוצלח בטיפול של הפרעות אוטואימוניות כגון רה
להעריך בו זמנית את התהליכים dysregulated המתוארים לעיל מספר ערכות המשנה תא החיסון, דגימות דם היקפיים של מירה כהן החולים בקרות בריא היו כמתואר לעיל מעובדים נותחו על ידי cytometry המוני. המוני cytometry, הידוע גם בשם Cytometry-זמן-של-טיסה, מציע ניתוח מתא בודד של פרמטרים מעל 40 בלי בעיות של ספקטרלי חופפים7,8,9. טכניקה זו מנצל איזוטופים נדירים מתכת בצורת יונים מתכתיים מסיסים כמו תגיות מוכרחים נוגדנים, במקום fluorophores10. ניתן למצוא פרטים נוספים על הפלטפורמה הטכנולוגית cytometry המוני (קרי, כוונון, כיול, דוגמת רכישה). Leipold et al. , מקארתי. et al. 11 , 12 הגבוה--ממדיות של cytometry המונים מאפשר מדידה סימולטני של ציטוקינים מרובים לאורך קבוצות משנה תא החיסון מולדים, גמישים עם צפיפות בתא יחיד (טבלה של חומרים).
פרמטרים קליניים ומעבדתיים קונבנציונליים הנוכחי הם לעתים קרובות אינם רגישים או ספציפית מספיק לגילוי פעילות המחלה מתמשך או התגובה immunomodulators ספציפיים13, המשקף את הצורך כדאי ניסחו את החיסון הבסיסי שינויים כי הכונן התלקחויות. נתון את התפשטותו של ציטוקין dysregulation מחלת חיסון עצמי, יש שפע של גישות טיפול להשתמש נוגדנים או מעכבי מולקולרי קטן מיקוד ציטוקינים או איתות החלבונים המעורבים ברגולציה של ייצור ציטוקינים לאחרונה הופיע. בתבנית בסיסית שלו, הגישה האנליטית דם היקפיים המתוארים כאן מספק פלטפורמה כדי לזהות קבוצות משנה ספציפי לחולה dysregulated תא ייצורם ציטוקין חריגה במחלות אוטואימוניות עם ביטויים מערכתית. מתודולוגיה זו מאפשרת התאמה אישית של אפשרויות טיפוליות כמו ציטוקינים dysregulated ספציפי ניתן לזהות, טיפול מיוחד אפשרויות יכול להיות נבדק לשעבר vivo כדי להעריך את היכולת שלהם immunomodulate המחלה הספציפי המטופל תהליך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי קולורדו מרובים מוסדיים סקירה לוח (COMIRB) של מאוניברסיטת קולורדו. כל ההליכים המתוארים להלן צריכה להתבצע בשכונה תרביות רקמה עקר אלא אם צוין אחרת, עם טיפים פיפטה מסוננים, ומסונן ריאגנטים כל.
1. הכנה של ריאגנטים לעיבוד דם היקפיים
- הכן ruxolitinib מניות aliquots (10-15 μL/מבחנה לשימוש יחיד)-10 מ מ על ידי דילול הכימית lyophilized ב דימתיל סולפוקסיד לפי הוראות היצרן (החנות ב-80 מעלות צלזיוס). שמור דימתיל סולפוקסיד ריכוז כל מבחני כולל פקדי unstimulated להלן 0.2% (vol/כרך).
- הכנת R848 (resiquimod) מניות aliquots (10-15 μL/מבחנה לשימוש יחיד) ב 1 μg/μL על ידי דילול הכימית lyophilized במים סטריליים כמו לפי הוראות היצרן. חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
- הכן ליפופוליסכריד (LPS) מניות aliquots (5 μL לכל מבחנה עבור שימוש פעם אחת בלבד)-1 μg/μL על ידי דילול הכימית lyophilized במים סטריליים לפי הוראות היצרן. חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
- הכינו את תא מכתים מדיה (CSM) באמצעות PBS, BSA 0.5% ו- נאן 0.02%3.
- לרכוש ולשמור מוכן את התחבורה מעכב (PTI) הקוקטייל של חלבון (טבלה של חומרים).
- להפשיר, לדלל את ruxolitinib מניות מבחנה (10 מ מ) 1:10 ב- PBS סטרילי (1 מ מ). להפריש בטמפרטורת החדר בשכונה תרביות רקמה.
- הפשרת ו לדלל המבחנה מניות R848 (1 μg/µL) 1:10 ב- PBS סטרילי (0.1 μg/µL). להפריש בטמפרטורת החדר בשכונה תרביות רקמה.
- הפשרת ו לדלל את בטחונות (1 μg/µL) מניות המבחנה LPS ב- PBS סטרילי (0.01 μg/µL). להפריש בטמפרטורת החדר בשכונה תרביות רקמה.
- לחמם RPMI סטרילי (אין-גלוטמין) בתוך אמבט מים רגילים-37 מעלות צלזיוס (עבור פחות 10 דקות).
- לדלל את המאגר lyse/תיקון על ידי 1:5 ב- ddH המסוננות2O (ריכוז בעבודה)-benchtop (לא צריך להיות סטרילי).
הערה: 1 מ"ל של דם מלא דורש 20 מ של ריכוז בעבודה מאגר lyse/תיקון.- להפוך מאגר lyse/תיקון 5 התנאים של 1 מ"ל של דם מלא לכל (לפחות 100 מ ל). Aliquot 20 מ של ריכוז העבודה lyse/תיקון מאגר לתוך צינורות חרוט 50 מ לכל מיליליטר של דם מלא (לשמור הפתרון lyse/תיקון ב 37 ° C עד שהוא נדרש). תווית התנאים על הצינורות חרוט המכיל מאגר lyse/תיקון כדלקמן: T0 (זמן 0), T6 + 5R (זמן 6 שעות עם 5 אום ruxolitinib), T6 + R848 (שעה 6 שעות עם 1 μg/mL R848), T6 + LPS (זמן 6 שעות עם 0.1 LPS μg/mL), T6 (שעה 6-אייץ ').
- תווית עגול התחתון צינורות פוליסטירן סטרילי עם כמוסות וצינורות microcentrifuge 1 מ"ל באותו המינוח כמו שלב 1.10.
2. גירוי ועיבוד של דם היקפיים (איור 1)
- מקם את שכותרתו עגול התחתון פוליסטירן צינורות מהשלב 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) על מתלה.
הערה: כל השלבים הבאים מבוצעות בסוג זה של הרכבת התחתית אלא אם צוין אחרת. קאפ הצינורות בעת העברת בין הוד תרביות רקמה חממה כדי לשמור על עקרות. - להוסיף 1 מ"ל של 37 ° C RPMI (לא-גלוטמין) לכל אחד הצינורות (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). היפוך הצינור אוסף דם מספר פעמים, להוסיף 1 מ"ל של דם מלא כל שפופרת, וכן פיפטה לאורך מספר פעמים לערבב ביסודיות עם RPMI (דילול עם RPMI מונע הצליעה של הדם במהלך תקופת הדגירה 6-אייץ ').
- להוסיף 10 μL של ה-1:10 ruxolitinib T6 + 5R. מערבבים היטב עם פיפטה P1000. למקם ארון התקשורת של צינורות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס ומתחיל עיתוי הדגירה (T = 0).
- תהליך הדגימה T0 כדלקמן.
- Pipette את כל התוכן של הצינור T0 לתוך צינור חרוטי שכותרתו המכיל 20 מ של 37 ° C עבודה ריכוז lyse/תיקון מאגר. כדי למטב את שחזור התא, לשטוף את הצינור עם עבודה ריכוז lyse/תיקון מאגר. מערבבים על-ידי היפוך הצינור חרוט.
- דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לאפשר פירוק, קיבעון. בעקבות קיבעון, ביצוע כל השלבים הבאים-benchtop. צנטריפוגה תאים ב 500 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- Decant את תגובת שיקוע. Resuspend תאי 1 מ"ל של PBS קר קרח להיפרד בגדר ולאחר מכן למלא חרוט לאמצעי 15 מ"ל עם PBS.
- Centrifuge התאים ב 500 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. Decant את תגובת שיקוע. חזור על לשטוף את PBS (צעדים 2.4.3–2.4.4) אם כדוריות אדומות. Resuspend תאי 1 מ"ל של CSM לפרק את צניפה, ולאחר מכן להעביר הצינור microcentrifuge שכותרתו (שלב 1.11) עבור צביעת נוגדן. לקחת דגימה µL 10 לספור תאים באמצעות מונה תא אוטומטית או hemocytometer.
הערה: מאז כל התאים קבועים בנקודה זו, אין צורך לכלול כתם הכדאיות. - Centrifuge התאים ב 500 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע, עוזב את צניפה ~ 60 µL אמצעי האחסון שיורית. שמור זה גלולה על הקרח עד דגימות תנאים אחרים השלמת עיבוד.
- ב T = 30 דקות, ידענו שזה צינור (שלב 2.3) מכסה המנוע תרביות רקמה ולבצע את הפעולות הבאות.
- להוסיף 10 μL של 0.1 μg/μL R848 T6 + R848. מערבבים היטב עם פיפטה P1000.
- להוסיף 10 μL של 0.01 μg/μL LPS T6 + LPS. מערבבים היטב עם פיפטה P1000.
- להוסיף 4 μL של חלבון התחבורה מעכב (מניות ב-500 X) T6, T6 + 5R, ו- T6 + LPS (אך לא T6 + R848), לחזור הדגימות החממה עד T = 6-אייץ לערבב ביסודיות עם פיפטה P1000 כל שעתיים.
הערה: R848 הוא אגוניסט TLR endoplasmic, ולכן דורש עיכוב זמני התוספת של החומר המדכא תחבורה חלבון כדי לאפשר גישה אל הקולטן היעד שלו.
- ב T = 2 h, להוסיף 4 μL של חלבון התחבורה מעכב קוקטייל (מניות ב-500 X) T6 + R848 צינור. מערבבים את כל הדגימות עם פיפטה P1000 ולחזור המדף החממה עד T = 6-אייץ '.
- מערבבים את הדגימות עם P1000 עוד פעם אחת ב- T = 4 שעות.
- ב T = 6 h, לעבד T6, T6 + LPS, T6 + R848 ו- T6 + צינורות דגימת דם 5R כפי שמתואר צעד 2.4 עבור המדגם T0.
- אחסן את כדורי תא בכרך CSM שיורית ב-80 מעלות צלזיוס לעבד על תאריך עתידי. לחלופין, להמשיך barcoding ונוגדן מכתים ללא אחסון.
3. ברקוד תאי דם Lysed/קבוע
- להפשיר את הדגימות תא lysed/קבוע מהמחסן-80 ° C לאט על הקרח; לכל היותר 20 דוגמאות ניתן שכותרתו עם ברקודים ייחודי, איחדו באמצעות מערכת זו. לדלל את המאגר פרם X barcoding 10 ב- 1:10 עם PBS; לעשות מספיק למאגר ~ 3 מ לכל דגימה.
- למלא אחד שוקת שאינו סטרילי של CSM ואחד עם המאגר פרם X barcoding 1. להוסיף 1 מ"ל של קרח CSM קר אל דגימות טריות המופשרים, לערבב היטב עם פיפטה, ולהעביר הצינורות בהתאמה מראש שכותרתו אשכול פוליפרופילן.
- לקחת דגימה μL 10 לספור תאים באמצעות מונה תא אוטומטית או hemocytometer. לנרמל את ספירת תאים ל- 1.5 – 2 x 106 תאים עבור דגימה בצינור כל אשכול: להסיר ולמחוק את עוצמת הקול של תאים עודף מעל 2 x 106 תאים.
- Centrifuge התאים ב- g x 600 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend תאי 1 מ"ל 1 מאגר פרם X barcoding עם פיפטה רב-ערוצי, צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. תשאף את תגובת שיקוע.
- בשורה הצינורות אשכול על מתלה באותו סדר כמצוין על המפתח ברקוד כך המדגם תואם עם ברקוד שלה. להוסיף μL 800 1 X barcoding פרם המאגר באמצעות פיפטה רב-ערוצי כל דוגמאות בתוך הצינורות האשכול מבלי לגעת בגדר תא עם העצות פיפטה (ללא ערבוב) כדי לצמצם את איבוד תאים. להפריש על האצטבה עם הצינורות אשכול.
- הסר 20-פלקס Pd Barcoding ערכת צינור רצועות-20 ° C, להפשיר בטמפרטורת החדר. להוסיף 100 μL 1 X barcoding פרם המאגר, לערבב ביסודיות, להעביר μL 120 של המיקס ברקוד resuspended לתוך הדגימות תא התואם את החצוצרות שלה אשכול.
- לערבב ביסודיות על ידי פיפטה רב-ערוצי, שהוא אין זיהום צולב בין דוגמאות לבר-קוד באופן אינדיבידואלי. דגירה אשכול צינורות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר את ברקודים לסמן את התאים.
- צנטריפוגה-g x 600 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר מכן resuspend ב 1 מ"ל של CSM.
- צנטריפוגה, resuspend ב CSM שוב כמו שלב 3.8.
הערה: כל מדגם עכשיו תווית ברקוד ייחודי, דגימות מוכנים להיות איחדו. - צנטריפוגה-g x 600 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, וארוקן את תגובת שיקוע. פיפטה של יחיד, משתמש הקצה אותו, להעביר את כל כדורי תא ~ 70 – 80 לאמצעי האחסון שפופרת אחת פוליסטירן שיורית μL. אין להוציא את הטיפ פיפטה; להפריש את פיפטה יחיד עם העצה הזאת.
- על פיפטה רב-ערוצי, עצות חדשות, להוסיף ~ 100 μL CSM כל שפופרת האשכול המקורי כדי ששחזור התא. עם הפיפטה יחיד עם קצה זה היה להפריש להעביר כל כדורי תא בכרך שיורית μL ~ 100 הצינור פוליסטירן אותו.
- הוסף CSM ולהשלמת הצינור פוליסטירן (~ 3 מ"ל). ספירת ולהקליט מספר הטלפון של הברקוד במאגר להגדיר. צנטריפוגה-g x 600 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, וארוקן את תגובת שיקוע. המשך מכתימה את הדגימות לבר-קוד באותו יום.
הערה: זה נורמלי לצפות איבוד תאים ~ 20 – 30% של תהליך barcoding.
4. כתמים לבר-קוד Lysed/נעוצות כדוריות הדם, הכנה לניתוח Cytometry המוני כלי
הערה: כל 1 X כייל של צביעת נוגדנים (μL 1 של נוגדנים לכל 100 μL מכתים התגובה), בדרך כלל יכול להכתים את 3-4 x 106 תאים. לכן, כאשר כל דוגמאות לבר-קוד הם איחדו לתוך שפופרת אחת, חייב להיות משתנה כמות נוגדנים. אם כמות דגימות לבר-קוד 20 כדי 30 x 106 תאים, כייל נוגדנים 1 לכל X יכול להכתים 3-4 x 106 תאים, המדגם לבר-קוד רק דורש של 10 X כייל נוגדנים, בניגוד מכתים כל דגימה באופן אינדיבידואלי, אשר ידרוש כמות X 20 של נוגדנים (1 X לכל הצינור בודדים). הריכוז של הנוגדן למספר התא צריך להיות טיטרציה בקפידה עבור כל נוגדן בודדים קוקטייל (לא נדון כאן).
- כתם התאים באמצעות נוגדנים (טבלה של חומרים) עבור משטח אינדוקציה מכתים, ציטוקינים.
- להפוך ההכתמה משטח קוקטייל על-ידי חישוב סכום נוסף וחשבונאות עבור טעות pipetting (קרי, אם צביעת לבר-קוד 20, דוגמאות 2 x 106 תאים בכל מדגם, 10 X כייל נוגדנים הכתם נדרש; עבור חישובי נפח סופי, לפצות על שגיאה pipetting על ידי ביצוע של 10.5 X הסופי מכתים פתרון).
- להוסיף 10 X שווה של משטח מכתים לאמצעי האחסון בגדר תא לבר-קוד. כדי לצמצם את איבוד תאים, עם הטיפ אותו, לערבב, למדוד את עוצמת הקול של כתמים השטח, תא גלולה.
- בהתבסס על הנפח של תאים, צביעת קוקטייל, להוסיף CSM נפח מכתימים הסופי של μL 50 לכל מספר דגימות תאים (כלומר, אם הרצת סט של 20 דגימות, μL 50 X 20 = 1 מ"ל). תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C. להתסיס את הדגימה כל 15 דקות כדי לקדם אפילו מכתים.
- במהלך הדגירה פני שטח הכתם, הכן המאגר פרם/לשטוף (טבלה של חומרים) על ידי 1:10 המדללת עם ddH המסוננות2O. הכן כרכים של mL 2 עבור permeabilization, ו- 5 מ"ל לרחצה. שמור ב 4 ° C או על קרח.
- להתעלות מעל פני השטח מכתים צינור עם CSM, צנטריפוגה ב g x 600 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. תשאף את תגובת שיקוע. Resuspend המדגם לבר-קוד ב- 2 מ של 4 ° C, 1:10 דילול שיער מקורזל/שטיפת מאגר. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות permeabilize באופן מלא את התאים.
- צנטריפוגה ב g x 600 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע.
- עבור צביעת תאיים, בצע שלבים דומים מכתימים (לגבי צביעת משטח). עם זאת, להשתמש 4 ° C, 1:10 דילול שיער מקורזל/שטיפת מאגר במקום CSM לעשות סה כ מכתימה את אמצעי האחסון כך התאים נשארים בסביבה permeabilizing ברחבי ההכתמה תאיים.
- מוסיפים נוגדן תאיים קוקטייל אל פני השטח צבעונית permeabilized תא גלולה (צעדים 4.1.2–4.1.17). שהכמות הכוללת צביעת לאמצעי האחסון μL 50 לכל מספר דגימות תאים. תקופת דגירה של 60 דקות ב 4 º C. להתסיס את הדגימה כל 15 דקות כדי להבטיח אפילו מכתים.
- במהלך ההכתמה תאיים, להכין את הפתרון intercalator: μL 900 של PBS מסוננות + μL 100% 16 מסוננים מחברים (הריכוז הסופי של 1.6% PFA) + 0.2 μL של 500 אום של צבע intercalator (טבלה של חומרים).
- בנוסף התא גלולה + קוקטייל עם 1:10 קר תאיים נוגדן מאגר פרם/שטיפה.
- צנטריפוגה ב g x 600 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר וארוקן את תגובת שיקוע. בנוסף ברכבת התחתית מכתימים עם CSM. לספור ולהקליט את המספר הסלולרי. צנטריפוגה ב g x 600 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר וארוקן את תגובת שיקוע. Resuspend תאי 1 מ"ל של פתרון intercalator מהשלב 4.9. תקופת דגירה של פחות 20 דקות בטמפרטורת החדר במשך העיבור מלא, או למשך הלילה ב 4 ° C (דוגמאות בפתרון intercalator יכול להישאר ב 4 ° C עד שבוע לפני הפעלת אותם על הכלי cytometry המוני).
- להכין את התאים המכשיר cytometry המוני.
- בנוסף את הצינור עם 3 מ"ל של ddH המסוננות2O, צנטריפוגה ב g 600 x דקות 5-4 מעלות צלזיוס. Resuspend התאים 3 מ"ל של ddH המסוננות2א תעבירי ההשעייה דרך מסנן 100 μm כדי להסיר את כל פסולת או אגרגטים כי פוטנציאלי יכול לסתום את המכשיר cytometry המוני.
- לספור והקלטה של סינון שלאחר מספר תאים. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות ב 4 ° C
- להכין את הפתרון חרוז כיול (טבלה של חומרים) על ידי דילול זה 1:10 ddH המסוננות2O.
- Resuspend את מוכתם בתאי האחסון הנדרש של 1:10 מדולל כיול פתרון חרוז להשגת ריכוז תא ~ 1 x 106 תאים למ"ל.
הערה: עבור CyTOF1 ב µL 45/דקה, אופטימום המומלץ הוא 5 x 105 תאים למ"ל; עבור Helios ב 30 µL/דקה, 7.5 x 105 תאים למ"ל. - להמשיך להפעיל את הדגימה על מכשיר cytometry המונית9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מדגים את זרימת העבודה עבור הגירוי ומובילים עיבוד הדגימות דם היקפיים, לרבות הקצאה של דם מדגם aliquots, העיתוי של התוספת של גירוי סוכנים, חלבון מעכב קוקטייל, דגירה פעמים עד פירוק תאי הדם האדומים (RBC) של קיבעון. הבחירה של סוכנים מגרה תלויות המסלולים איתות, ציטוקינים המיועדים להערכה. לדוגמה, בפרוטוקול המתוארים כאן, אגוניסטים TLR משמשים כדי להעריך מולדת מנגנוני חישה מערכת החיסון סוגי תאים מרובים. נציג חוץ-תאית (LPS, אגוניסט TLR4), endoplasmic (R848, TLR7/8 אגוניסט) אגוניסטים נבחרו. סוכנים מגרה אחרים כוללים 13 12-פעילים Phorbol-אצטט (PMA) Ionomycin (PMAIONO), אשר יכול לשמש תא T מפעילים. ציטוקינים ספציפי יכול לשמש גם מגרה סוכנים, יחד עם אנטיגנים ספציפיים אחרים B ו- T cell.
כדי להדגים את הגישה ניסיוני שמתואר פרוטוקול זה, איור 2, איור 3ו- 4 איור הצג תוצאות נציג שהושג באמצעות תקליטונים, R848 PMAIONO כמו מגרה תנאים. בזמן השימוש PMAIONO תוארה לא בפרוטוקול, הנתונים מוצגים באיור 3 ו- 4 איור להדגים כי סוגי תאים שונים (וגם סלקטיבי) ו ציטוקינים הם מופעל/המושרה בתגובה אגוניסטים TLR (LPS ו- R848) נגד T אמינוגן (PMAIONO). בהתחשב בכך סמני פני 26 (טבלה של חומרים) שימשו לתיחום קבוצות משנה מרובים תא החיסון מולדים, גמישים, שונים T, B, NK, מונוציט ו תא דנדריטי קבוצות משנה יכולים בו זמנית להילמד בתוך דוגמה אחת. בנוסף, סמנים של הפעלת תא החיסון כלולים גם, כגון CD86 או ICOS עבור תאי B ו- PD1 על תאי T. נציג מוגבל gating אסטרטגיה הממחיש את ההערכה של CD14hi ומונוציטים מוצג באיור2. עם זאת, עוד יותר מפורט, gating המורחב של T, B, NK, מונוציט, דנדריטים, קבוצות משנה תא granulocytic ניתן למצוא בעבודתנו שפורסמו ב. O'Gorman, Hsieh et al. ו. O'Gorman וקונג et al. 14 , 15 . בנוסף, ללא השגחה שיטות ניתוח כולל (ולא רק) ספייד16visNE17, הדר18, Phenograph19, Xshift20 יכול לשמש כדי להעריך נתונים cytometry המונית (לא דנו כאן). שימוש CD14hi ומונוציטים ותאי CD4 T בתור נציג תא החיסון מולדים, מסתגלת קבוצות משנה, נתונים הוכחת ציטוקין אינדוקציה בתוך סוגי תאים אלה מוצגים באיור3. מספר נבחר של ציטוקינים נבחר כדי להראות כי R848 באופן סלקטיבי המניע IL-12 (p40 יחידה משנית), MCP1 ב CD14hi ומונוציטים תוך LPS אינה (איור 3). PMAIONO, חזק T cell activator לא לגרום ציטוקינים ב CD14hi ומונוציטים (איור 3) אך זירוז אינטרפרון גמא (IFNγ) ואת הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNFα) בתאי CD4 T (איור 4). טכניקה מוצלחת גירוי דגימת דם היקפיים ועיבוד תדגים דפוסים של ציטוקין אינדוקציה מסוים התנאים מגרה, המערכת החיסונית קבוצות משנה, כפי שהודגם ב איור 3 ו- 4 איור. עבור ניתוח מלא של ציטוקינים 14 המתוארים כאן סוגי תאים שנלכדו בתוך סמני פני 26, נא עיין. O'Gorman, Hsieh et al., ו. O'Gorman וקונג et al. 14 , 15
כדי להדגים כיצד הגישה ניסיוני שמתואר פרוטוקול זה לוכדת המדינה פתוגניים "פנימי" של מחלה אוטואימונית מערכתית כגון ב- SLE בהשוואה תורם בריא, איור 5 ממחיש את אינדוקציה ציטוקין (Mip1β, MCP1) ב CD14hi ומונוציטים שנמצאו בחלק הפגוע דם היקפיים מדגם היחידה (B), בהיעדר של כל גירוי אקסוגני (T6 לעומת T0). ציטוקינים אלה הם "מאופנן/ירד" מאת JAK עיכוב טיפול ruxolitinib (T6 + 5R בהשוואה T6) בחודש דם היקפיים חולה הדוגמה היחידה (חלק ב').
איור 1. זרימת עבודה ניסויית גירוי ועיבוד של דם היקפיים לניתוח cytometry המונית. פרוטוקול עבור פירוק RBC וקיבוע של המחלה (T0) איסוף הבאות מיד דגימת דם היקפיים, או לאחר דגירה 6-אייץ ' ב 37 ° C עם מעכב תחבורה חלבון (PTI) בהיעדר כל סוכן אקסוגני (T6), או עם LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848; חלבון התחבורה מעכב הדגירה במשך 4 שעות בלבד), או ruxolitinib (T6 + 5R). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. נציג gating אסטרטגיה לצורך זיהוי CD14hi ומונוציטים. בעקבות קיבוע RBC פירוק, הפרט lysed/קבוע דגימות תאים מתורם בריא היו לבר-קוד, המסומנת 26 נוגדנים נגד סמני פני השטח, permeabilized, מוכתם 14 נוגדנים נגד ציטוקינים (טבלה של חומרים). האסטרטגיה המגביל מוגבל המייצג את הזיהוי של CD14hi ומונוציטים מוצג. משמאל לימין, חלקה 2D ייצג הוא תת-קבוצה האוכלוסייה מן האוכלוסיה האב היא מגודרת (הקופסה הכחולה) מן העלילה 2D מיד שמאלה. אסטרטגיית חסימה ממושכת יכול להימצא ב. O'Gorman, Hsieh et al., ו. O'Gorman וקונג et al. 14 , 15 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. דוגמה האינדוקציה ציטוקין ב CD14hi ומונוציטים בעקבות גירוי עם התקליטים, R848 PMAIONO. ניתוח cytometry המוני נציג של דם היקפיים דגימות מתורם בריא בזמן אפס (T0), unstimulated (T6), ובעקבות גירוי עם LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), PMAIONO (T6 + PMAIONO) מוצג. דוגמה אינדוקציה ציטוקין ב CD14hi ומונוציטים מוצג; ציטוקינים שנבחרו עם ירידה לפרטים בסוכן מגרה בשימוש (אגוניסט TLR לעומת T cell activator) מתוארים. ניתן למצוא נתונים מורחבים עבור כל אינדוקציה ציטוקין על פני מספר קבוצות משנה תא החיסון לקביעה עם לוח נוגדן זה cytometry המונית. O'Gorman, Hsieh et al., ו. O'Gorman וקונג et al. 14 , 15 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. דוגמה האינדוקציה ציטוקין ב- CD4 T תאים בעקבות גירוי עם התקליטים, R848 PMAIONO. ניתוח cytometry המוני נציג של דם היקפיים דגימות מתורם בריא בזמן אפס (T0), unstimulated (T6), ובעקבות גירוי עם LPS (T6 + LPS), R848 (T6 + R848), PMAIONO (T6 + PMAIONO) מוצג. דוגמה האינדוקציה ציטוקין בתאי CD4 T מוצג; ציטוקינים שנבחרו עם ירידה לפרטים בסוכן מגרה בשימוש (אגוניסט TLR לעומת T cell activator) מתוארים. ניתן למצוא נתונים מורחבים עבור כל אינדוקציה ציטוקין על פני מספר קבוצות משנה תא החיסון לקביעה עם לוח נוגדן זה cytometry המונית. O'Gorman, Hsieh et al., ו. O'Gorman וקונג et al. 14 , 15 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. דוגמה האינדוקציה ציטוקין ב CD14hi ומונוציטים מהמטופלת המחלה מירה כהן. ניתוח cytometry המוני נציג של דגימות הדם ההיקפיים בריאה תורמים (A), מירה כהן המחלה החולה (B) מוצגים. דוגמאות אינדוקציה ציטוקין ב CD14hi ומונוציטים; נבחרת ציטוקינים עם ירידה לפרטים לתהליך ה מירה כהן מחלת "מהותי" פתוגניים (T6) (קרי, אינדוקציה של MIP1β ו- MCP1 רק אצל המטופל מירה כהן), ואת ההשפעה של ruxolitinib immunomodulator (T6 + 5R) מתוארים. ניתן למצוא נתונים מורחבים עבור כל אינדוקציה ציטוקין על פני מספר קבוצות משנה תא החיסון לקביעה עם לוח נוגדן זה cytometry המונית. O'Gorman וקונג et al. 15 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן נתאר את הרומן, תא בודד, פרוטיאומיה מבנית גישה בו זמנית להעריך מספר סוגי תאים חיסוניים, לזהות חצרו של המטופל הספציפי "פתוגניים" פלזמה דם היקפיים במחזור גורמים לפליטת ציטוקינים שונים שלהם. שיטה זו מעסיקה דם היקפיים ' הרכב אנליטית, וכן cytometry המונית של הכלי על ההערכה של מערכת החיסון התאית חריגות פנוטיפי ופונקציונליים. השיטה בקלות החלים על מחקרים של אדם ועכברים -21, והוא תואם עם אנליזה פונקציונלית חיסוניים אחרים, כגון גילוי מומים איתות14.
המשתמש צריך להיות מודע לסכנה של מספר משתנים אשר יכולים להשפיע על ההצלחה של הליך זה. על סמך הניסיון שלנו, דגימות דם צריך להיות מעובד בתוך 2 h של אוסף כדי להימנע בסיסית אינדוקציה של ציטוקינים תאיים (נתונים לא מוצג). דגימות דם צריכים להישאר בטמפרטורת החדר (25 ° C) בזמן ההמתנה עיבוד. ניתן לאסוף דגימות דם בנתרן או הפרין או EDTA צינורות, ללא הפרעה עם וזמינותו המתואר. חיים, אפליה התא מת יכול להיות מוערך על ידי המוני cytometry באמצעות ציספלטין22. עם זאת, ההערכה כזה מושמט בפרוטוקול שתוארו לעיל בהנחה דם מעובד באופן מיידי (או בתוך 2 h) אחרי אוסף. בנוסף, גם אם הדגימות עוכבו בעיבוד, העדר הקפאה קריוגנית מאפשר העדרו של אפליה חי/מת. אנחנו, לעומת זאת, ממליץ השימוש של ציספלטין עבור הכדאיות אפליה בכל מחקר שבו מוות תאי להשפיע על התוצאה של הניתוח במורד הזרם.
בנוסף, מצאנו כי בחירה נכונה של טיטור של הסוכן מגרה חיונית חישוב מסלולים המערכת החיסונית יישוב/ציטוקין אינדוקציה. ראשית, הבחירה של הסוכן מגרה צריך להיות מבוסס על 1) מערכת החיסון מסלולים נועדה לעסוק/להעריך, ו- 2) ממוקד המפרט פונקציונלי (בין אם איתות ייצור חלבונים או ציטוקינים). לדוגמה, אם המטרה להעריך את תא T ההפעלה ואת שונה T helper תא (ה) תת-ערכות שלהם אינדוקציה ציטוקין בהתאמה, PMAIONO או שילוב של אנטי-CD3/אנטי-CD28 יהיה תנאי המתאימים עירור. עם זאת, אם המטרה להעריך מונוציט משנה הפעלה, אגוניסט TLR (או צירוף של שתיהן) עשויה להועיל. שנית, הריכוז לכל הסוכנים האלה, מגרה צריך להיות מותאם שמעודדים לתא ההפעלה ומעגל ציטוקינים, מבלי לשנות באופן חמור את סמני פני השטח של התא. השימוש הסוכן מגרה מעט מדי ולא תוביל ההפעלה של סוגי התאים הרצויים, אינדוקציה ציטוקין לא יתקיימו, ואילו השימוש מדי תוביל למוות תא מופרז, שינויי מערכת החיסון תא סמני פני השטח כך זוהו אוכלוסיות מצב unstimulated לא יהיה נוכח המצב מגורה. שלישית, קינטיקה של הגירוי גם הוא משתנה חשוב. בעוד 6-אייץ ' שפורסם בעבר כמו פרק זמן גירוי אופטימלית כדי ללכוד אינדוקציה מקסימלי של ציטוקינים פרו-דלקתיים בתגובה TLR גירוי14,23, timepoint גירוי שונים עשוי להיות נחוץ עבור סוכנים אחרים. באופן דומה, השימוש של כל תרופה טיפולית במבחנה עם דוגמיות דם היקפיים צריך גם להיות טיטרציה באופן זהה כסוכן מגרה, תוך מתן תשומת לב ריכוז ו- timepoint.
ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים דגימות דם היקפיים טריים, אינדוקציה ציטוקין תאיים (וזיהוי) היא יותר חזקה ויעילה לעומת דגימות cryopreserved. נתאר כאן בפרוטוקול השימוש של דם מלא בניגוד PBMCs, כמו הנוכחות של פלסמה, שנפוצו גורמים תורמת מהות "מהותי" העיוותים החיסון הקשורות לתהליך המחלה. גורמים אלה מחזורי-פלזמה עלולים להפריע תנאי נוסף על הדם כל ציוד היקפי, כגון התוספת של אנטי-IgM ומעורר אנטי-אג לעסוק הקולטן תא B, ככל שהם קשורים על ידי פלסמה, שנפוצו נוגדנים, כדוריות דם אדומות. לכן, בחירה נכונה של מגרה תנאי כאשר באמצעות דם היקפיים הוא קריטי עבור ניסויים מוצלחים לקרוא פסולים. באמצעות דם היקפיים יש היתרונות (ויוו רציף), חסרונות (פלזמה מפריעות גורמים במחזור). עם זאת, PBMCs מציעים סט שונה של "בעד" ונגד "." כאשר PBMCs טריים (בניגוד דם) עוברים באותו התהליך/הפרוטוקול, עם גירוי באמצעות סוכנים TLR שונים, ראינו אותו "דפוס" האינדוקציה ציטוקינים, אף על פי שזה כדי14,בעוצמה פחותה במקצת23. בעקבות פרוטוקול זה, השימוש PBMCs קפוא מוביל אינדוקציה ציטוקין פחות חזקים, לכן אנו ממליצים נגד ישירות השוואת תוצאות דגימות מעובד לאחר הקפאה קריוגנית עם אלה עיבוד טרי.
בהתחשב אזהרה של טריות לעומת דגימות קפואים, ואת ההעדפה לשימוש של דגימות טריות איכות הנתונים אופטימלית, הפרוטוקול המתואר כאן מתאים בבני אדם פוטנציאליים שבו המטופל דגימות נאספים על פני פרק זמן של חודשים עד שנים. דגימות דם היקפיים יעובד כמתואר, ברגע שיגיעו על הבמה פירוק, קיבוע של RBC, יכול להיות מאוחסן ב- 80 ° C ודוגמאות צבעונית בקבוצות מאוחר יותר. גישה טכנית זו, בעוד יתרון ללימודים האנושי ביותר, גם מהווה את האתגר של באמצעות נוגדנים יכולים לאגד epitope היעד לאחר קיבוע. טבלה של חומרים מפרט השיבוטים של נוגדנים המתאימים נבדקו, להדגים קיבוע פוסט מכתימים ספציפיים. Barcoding דוגמאות מרובות (n = 20) מציע את היתרונות של 1) ירד השתנות טכני, כמו מספר דוגמאות מוכתמים ביחד על שפופרת אחת, ולכן עושה השוואות של דגימות מעבר תנאים די עקבית ומהימנה; 2) הפחתת השימוש הכולל נוגדנים (ראה פרוטוקול סעיף 4.1); ו 3) התכנית barcoding של "6 פלדיום שונים איזוטופים/לבחור 3" מוביל הדרה של doublets (תאים בבדיקת איזוטופים פלדיום יותר מ-4). יתרונות אלה הם דנו בפירוט. Zunder ו Fick et al. 24 . בנוסף, תהליך barcoding דורש כי התאים להיות קבוע, כפי שהם צריכים להיות במתינות permeabilized עבור העיבור של ריאגנט (איזוטופים פלדיום) barcoding24. לכן, צביעת בשידור חי אין אפשרות לבצע בעקבות פרוטוקול זה. יצוין כי barcoding תא חי (בניגוד barcoding תא קבוע המתוארים כאן) הוא האפשרות25,26, אבל בפרוטוקול כאן, התאים הם קבועים כך ניתן לאחסנם ומעובדים אצווה יחד.
דוגמת עיבוד אצווה, עוד יתרון של עבודה, זמן יעילות עמדה, גם יש אתגרים משלו. עם עיבוד אצווה יש צורך עבור תהליך הנורמליזציה אצר בקפידה. תהליך הנורמליזציה זה ניתן לטפל בשלבים שונים של cytometry מסת זרימת העבודה. ראשית, ריכוז נוגדן למספר תאים יש לשמור עקבית על פני קבוצות. מצאנו דרך יעילה להשגת ריכוז עקבי הזה. הוא על-ידי טיטור 1) זהיר של ריכוז נוגדן תא מספר 2) נורמליזציה של המספר הנייד של כל הדגימות כי הם לבר-קוד יחד (קרי, 1 מיליון תאים עבור דגימה, עבור כל הדגימות לבר-קוד 20). שנית, להביא בחשבון השתנות עוצמת אות כלי (שונה ימים של כוונון, כיול, ריקבון אות לאורך זמן ריצה), צריך להיות resuspended ודוגמאות מנותח על cytometer המוני עם פתרון חרוז נורמליזציה המתאים (טבלה החומרים), ואחריו נרמול הקבצים לאחר רכישת נתונים27 (אך לפני debarcoding). Debarcoded הם דוגמאות בודדות לאחר שהקובץ כולו לבר-קוד כבר חזר למצב רגיל באמצעות הכלים המתוארים. Zunder ו- Finck et al. 24 . שלישית, להביא בחשבון נוגדן ידנית מכתים השתנות טכני, אנו ממליצים ההכללה של דוגמה "עוגן" עם כל ערכה ברקוד ניתוח מחקר יחיד, דהיינו, דוגמה אחת היא מתורם אחד (בבני אדם), עברה עיבוד באותו אופן כמו הדגימות מחקר אחרים. דוגמה זו צריכה להיווצר פעם בכמות גדולה מספיק יחולקו לתוך כל ערכת ברקוד נותחו לצורך המחקר. דגימות אלה עיגון כל ברקוד ישמש להפקת מקדם השונות לתיקון אות השתנות מדגמים המחקר הזה ברקוד (קרי, עוגן מדגם ברקוד 8 ישמש לתיקון השתנות ב ברקוד 8).
עוד צעד חשוב אופטימיזציה הוא ההרכבה של לוח נוגדן cytometry המונית, אשר יהיה להעריך תא החיסון הרלוונטיים קבוצות משנה של ציטוקינים. חלק משתני מפתח נוגדנים פאנל הרכבה כולל הבחירה של שיבוטים (התייחס לעיל), כייל נוגדנים לאות רקע מינימלי, בחירה של נוגדן מטרות וערוצי איזוטופ המבוסס על שפע אנטיגן ורגישות הערוץ " פיצוי"והתאמת אות המבוסס על הטומאה איזוטופ חמצון, ואת השתנות רבה נוגדן בודדים. השלבים אופטימיזציה המטופלות במקום28 ולא בתוך הטווח של הפרוטוקול המתואר כאן.
באמצעות גישה זו תא בודד פרוטיאומיה מבנית ללמוד ליקויים החיסונית בדגימות דם היקפיים, זה ניתן לזהות פנוטיפים חריג של תאים חיסוניים קבוצות משנה, בין אם זה הפרשי תדירות האוכלוסייה או שינויים בביטוי של סמנים משטח תאים מסוים (כגון סמני של הפעלת התא). בנוסף, זה גם ניתן לזהות חריגות פונקציונלי בתוך תא החיסון קבוצות משנה, כגון כמו תחת או עודף של ציטוקינים. לבסוף, מדגים תהליך ההשוואה המדגם של תהליכים פתוגניים "מהותי", להוביל תא החיסון ציטוקין וסוג חריגות (T6-T0) מיד קבוע (T0) לעומת קבוע אחרי 6 שעות של דגירה ללא סוכן אקסוגני (T6). גישה זו יכולה להיות לצרכיו המחקר של מגוון תהליכים בתיווך החיסונית מערכתית, מעורבותם של תאים חיסוניים קבוצות משנה מרובים מסלולים בהתאם הסוכן גירוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות איימי ששחה-ברנרד שלה קלט רוחני והערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי וארינג Boettcher קרן וב פרס המחקר הביו-רפואי ופרס שהמספר K23-1K23AR070897 מ- NIH אלנה W.Y. Hsieh. היא גם נתמך על ידי פרס מספר K12-HD000850 מן המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר בריאות הילד ואת ההתפתחות האנושית קרן ולוסיל פקארד בריאות לילדים, סטנפורד CTSA UL1 TR001085 של מחקר בריאות הילד אוניברסיטת המכון של סטנפורד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ruxolitinib | Santa Cruz | SC-364729A | Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL |
| Sterile PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O) |
| BD Phosflow perm/wash buffer I | BD biosciences | 557885 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002 |
| Protein Transport Inhibitor (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM |
| Cell Staining Media (CSM) | PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm Buffer | Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 20-plex Pd Barcode Set | Fluidigm | S0014 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| EQ TM Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X |
| 16% MeOH-free Formaldehyde Solution | Thermo | 28908 | Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v) |
| Sterile round bottom polystyrene tubes | VWR | 60818-496 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Polypropylene cluster tubes | Light Labs | A-9001 | Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a |
| Helios CyTOF instrument | Fluidigm | Helios | All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies used for Mass Cytometry | |||
| Surface markers | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Mass: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Mass: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Mass: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Mass: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Mass: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Mass: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Mass: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Mass: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Mass: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Mass: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Mass: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Mass: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Mass: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Mass: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Mass: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Mass: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Mass: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Mass: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Mass: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Mass: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Mass: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Mass: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Mass: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Mass: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Mass: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Mass: 167 |
| Cytokines | |||
| IL-1α | Biolegend | 364-3B3-14 | Mass: 147 |
| IL-1β | Biolegend | H1b-98 | Mass: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Mass: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Mass: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Mass: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Mass: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Mass: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Mass: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Mass: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Mass: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Mass: 175 |
| IFNγ | Biolegend | 4S.B3 | Mass: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Mass: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Mass: 166 |
| Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. |
References
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s. Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).
- Kaul, A., Gordon, C., et al. Systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Disease primers. 2, 16039 (2016).
- Annunziato, F., Romagnani, S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257 (2009).
- Peck, A., Mellins, E. D. Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example. Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).
- Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. More stories on Th17 cells. Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).
- Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. Highly multiparametric analysis by mass cytometry. Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
- Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398 (2012).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).
- Rahman, A., Isenberg, D. A.
- O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus. The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).
- O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients. Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).
- Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).
- Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).
- Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).
- Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis. Cell. 162 (1), 184-197 (2015).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).
- Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system. Science. 349 (6244), 1259425 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
- Jansen, K., Blimkie, D., et al. Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation. Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).
- Zunder, E. R., Finck, R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry Part A. , (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
- Finck, R., Simonds, E. F., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
