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Immunology and Infection

Immunophenotype और परिधीय पूरे रक्त में Cytokine उत्पादन का एकल सेल विश्लेषण के माध्यम से मास Cytometry

Published: June 26, 2018 doi: 10.3791/57780
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1,3
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम एक एकल सेल proteomic दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए प्रतिरक्षा phenotypic और कार्यात्मक (intracellular cytokine प्रेरण) परिधीय पूरे रक्त के नमूनों में परिवर्तन का मूल्यांकन, जन cytometry के माध्यम से विश्लेषण किया ।

Abstract

साइटोकिंस स्व-प्रतिरक्षित रोगों के रोगजनन में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं । इसलिए, cytokine स्तर की माप के लिए एक सटीक तंत्र है कि आत्म सहनशीलता और बाद में प्रतिरक्षा के टूटने के लिए नेतृत्व को समझने की कोशिश में कई अध्ययनों का ध्यान केंद्रित किया गया है । दृष्टिकोण इस प्रकार अभी तक प्रतिरक्षा प्रणाली के एक विशिष्ट पहलू के अध्ययन के आधार पर किया गया है (एक या कुछ सेल प्रकार या साइटोकिंस), और जटिल स्व-प्रतिरक्षित रोग के एक वैश्विक आकलन की पेशकश नहीं है । जबकि रोगी सीरा आधारित अध्ययन प्रतिरक्षा में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि afforded है, वे विशिष्ट सेलुलर स्रोत dysregulated साइटोकिंस का पता नहीं प्रदान करते हैं । एक व्यापक एकल सेल दृष्टिकोण कई प्रतिरक्षा सेल उपसमुच्चय में cytokine उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए, "आंतरिक" रोगी के संदर्भ में विशिष्ट प्लाज्मा परिचालित कारकों के भीतर, यहां वर्णित है । इस दृष्टिकोण के रोगी-विशिष्ट प्रतिरक्षा phenotype (सतह मार्कर) और समारोह (साइटोकिंस) की निगरानी में सक्षम बनाता है, या तो अपने मूल "आंतरिक रोगजनक" रोग राज्य में, या चिकित्सीय एजेंटों की उपस्थिति में (vivo या पूर्व vivoमें ) ।

Introduction

स्व-प्रतिरक्षित रोग रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण जनसंख्या के 3-8% को प्रभावित कर रहे हैं । संयुक्त राज्य अमेरिका में, स्व-प्रतिरक्षित विकारों युवा और मध्यम आयु वर्ग की महिलाओं (उम्र < 65 वर्ष)1,2के बीच मौत के प्रमुख कारणों में से हैं । स्व-प्रतिरक्षित विकारों विषम नैदानिक प्रस्तुति और विविध अंतर्निहित प्रतिरक्षा प्रक्रियाओं की विशेषता है । विविधता के स्पेक्ट्रम में अच्छी तरह से विभिंन विकारों के पार का प्रतिनिधित्व किया है, जैसे रुमेटी गठिया में संयुक्त भागीदारी (आरए) और एकाधिक स्केलेरोसिस में स्नायविक रोग (एमएस) । हालांकि, विविधता के इस स्तर को भी एक विकार के भीतर उदाहरण है, जैसे प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष ल्यूपस (SLE): कुछ रोगियों को गुर्दे की विकृति के साथ मौजूद हो सकता है, जबकि अंय hematologic या संयुक्त भागीदारी3से ग्रस्त हैं ।

स्व-प्रतिरक्षित विकारों में अंतर्निहित immunopathogenesis नैदानिक विविधता का दर्पण है, जिसमें कई जंमजात और अनुकूली प्रतिरक्षा सेल सबसेट के ऑटो और अति-सक्रियण शामिल हैं, और सहवर्ती dysregulated cytokine उत्पादन । जबकि साइटोकिंस स्व-प्रतिरक्षित रोग के रोगजनन में एक निर्णायक भूमिका निभाते हैं, रोग के तंत्र में उनकी विशिष्ट भूमिका को समझना चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है. साइटोकिंस pleiotropy (एक cytokine विभिन्न प्रकार के सेल पर कई प्रभाव हो सकता है) की विशेषता है, अतिरेक (एकाधिक साइटोकिंस एक ही प्रभाव हो सकता है), द्वंद्व (एक cytokine विभिन्न स्थितियों के तहत समर्थक या विरोधी भड़काऊ प्रभाव हो सकता है), और प्लास्टिक (साइटोकिंस एक अपनी "मूल" एक से अलग भूमिका में ढाला जा सकता है, पर्यावरण पर निर्भर करता है)4,5,6। फलस्वरूप, जनसंख्या-स्तर के तरीके विषम सेलुलर प्रतिक्रियाओं को समान "cytokine वातावरण" में भेद नहीं सकते. इसी तरह, अध्ययन डिजाइन कि प्रतिरक्षा प्रणाली के एक विशिष्ट पहलू पर ध्यान केंद्रित (एक एकल कोशिका प्रकार या cytokine), जटिल स्व-प्रतिरक्षित रोग में शामिल सभी तत्वों का एक वैश्विक आकलन प्रदान नहीं करते. जबकि रोगी सीरा आधारित अध्ययन प्रतिरक्षा में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि afforded है, वे विशिष्ट सेलुलर स्रोत dysregulated साइटोकिंस का पता नहीं प्रदान करते हैं ।

हाल ही में, हम एक साथ एक एकल सेल proteomic दृष्टिकोण विकसित करने के लिए एक साथ कई प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार का आकलन है, और रोगी विशिष्ट "रोगजनक" परिधीय रक्त प्लाज्मा परिसंचारी कारकों के वातावरण में उनके विभिंन cytokine perturbations का पता लगाने । कार्यप्रवाह यहां वर्णित बरकरार परिधीय पूरे रक्त के नमूनों के उपयोग की विशेषता है, के रूप में अलग परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) का विरोध किया । परिधीय पूरे रक्त सबसे शारीरिक प्रासंगिक वाहन का प्रतिनिधित्व करता है प्रणालीगत प्रतिरक्षा-मध्यस्थता रोग का अध्ययन, 1 सहित) गैर mononuclear रक्त कोशिकाओं अक्सर स्व-प्रतिरक्षित रोग में शामिल (यानी, न्यूट्रोफिल, प्लेटलेट्स), और 2) प्लाज्मा परिसंचारी कारकों, जैसे न्यूक्लिक एसिड, प्रतिरक्षा परिसर, और साइटोकिंस, जो प्रतिरक्षा सक्रिय भूमिकाओं है । "आंतरिक रोगजनक" dysregulated cytokine उत्पादन पर कब्जा करने के लिए, परिधीय रक्त के नमूनों तुरंत रक्त आकर्षित (टी0, समय शून्य) के बाद संसाधित कर रहे हैं, और ३७ डिग्री सेल्सियस (शारीरिक शरीर के तापमान) के साथ 6 ज के बाद एक प्रोटीन परिवहन के साथ किसी भी exogenous उत्तेजक हालत (T6, समय 6 एच) के अभाव में अवरोधक, cytokine उत्पादन का पता लगाने के लिए (संचय, T6-टी0) कि "आंतरिक" रोग राज्य (चित्रा 1) को प्रतिबिंबित करेगा । dysregulated प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कि पर या के तहत-सक्रियण रोग के लिए प्रासंगिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में शामिल संकेत मार्ग के सक्रियकरण, परिधीय रक्त के नमूनों का इलाज कर रहे हैं (6 एच ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक प्रोटीन परिवहन अवरोधक के साथ) एक exogenous के साथ उत्तेजक हालत कि रोग रोगजनन को दर्शाता है, जैसे टोल जैसे-रिसेप्टर (TLR) एगोनिस्ट के मामले में SLE (T6 + R848, टाइम 6 एच के साथ 1 µ जी/एमएल R848), cytokine उत्पादन है कि न्यूक्लिक एसिड की प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित करेगा का पता लगाने के लिए (टी0 बनाम T6 बनाम T6 की तुलना + R848, चित्रा १). उपलब्ध चिकित्सकीय के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव का अध्ययन करने के लिए पूर्व vivo, के रूप में वे विशिष्ट रोगियों के लिए सटीक प्रतिरक्षा dysregulated प्रक्रियाओं से संबंधित, परिधीय रक्त के नमूनों प्रासंगिक चिकित्सकीय पर एक JAK अवरोधक के साथ इलाज कर रहे हैं एकाग्रता (यहां, 5 उम ruxolitinib; T6 + 5R, समय 6 ज 5 उम ruxolitinib के साथ), दवा के जवाब में "आंतरिक" रोग राज्य में परिवर्तन का पता लगाने के लिए (टी0 बनाम T6 बनाम T6 + 5R, चित्रा 1) । एक JAK अवरोधक इस अध्ययन के लिए चुना गया था क्योंकि JAK अवरोधकों ऐसे आरए के रूप में स्व-प्रतिरक्षित विकारों के उपचार में सफल होने के लिए दिखाया गया है ।

एक साथ एक से अधिक प्रतिरक्षा सेल सबसेट में ऊपर वर्णित dysregulated प्रक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए, परिधीय रक्त के नमूनों SLE रोगियों और स्वस्थ नियंत्रण से ऊपर वर्णित के रूप में संसाधित किया गया था और जन cytometry द्वारा विश्लेषण. मास cytometry, भी cytometry के समय के रूप में जाना-उड़ान, वर्णक्रमीय ओवरलैप के मुद्दों के बिना ४० से अधिक मापदंडों के एकल सेल विश्लेषण प्रदान करता है7,8,9. इस तकनीक के बजाय fluorophores10के एंटीबॉडी के लिए बाध्य टैग के रूप में घुलनशील धातु आयनों के रूप में दुर्लभ पृथ्वी धातु आइसोटोप का इस्तेमाल करता है. मास cytometry तकनीकी मंच के बारे में अतिरिक्त विवरण (यानी, ट्यूनिंग और अंशांकन, नमूना अधिग्रहण) Leipold एट अल. और McCarthy एट अल में पाया जा सकता है । 11 , 12 जन cytometry की उच्च आयामी एकल कोशिका दानेदार (सामग्री की तालिका) के साथ सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा सेल सबसेट भर में एकाधिक साइटोकिंस के एक साथ माप सक्षम बनाता है ।

वर्तमान पारंपरिक नैदानिक और प्रयोगशाला पैरामीटर्स अक्सर संवेदनशील या विशिष्ट immunomodulators13के लिए चल रहे रोग गतिविधि या प्रतिक्रिया का पता लगाने के लिए पर्याप्त नहीं हैं, बेहतर अंतर्निहित प्रतिरक्षा चित्रित करने की आवश्यकता को प्रतिबिंबित परिवर्तन है कि ड्राइव भड़क अप । स्व-प्रतिरक्षित रोग में cytokine dysregulation के व्यापकता को देखते हुए, उपचार दृष्टिकोण है कि उपयोग एंटीबॉडी या छोटे आणविक अवरोधकों साइटोकिंस या संकेतन प्रोटीन cytokine उत्पादन के विनियमन में शामिल लक्ष्यीकरण के ढेर सारे हाल ही में उभरा । अपने बुनियादी प्रारूप में, परिधीय रक्त विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण यहां वर्णित एक मंच प्रदान करता है रोगी की पहचान करने के लिए विशिष्ट dysregulated सेल सबसेट और प्रणालीगत अभिव्यक्तियों के साथ स्व-प्रतिरक्षित रोग में उनके असामांय cytokine उत्पादन । यह पद्धति चिकित्सीय विकल्पों के निजीकरण के लिए अनुमति देता है के रूप में विशिष्ट dysregulated साइटोकिंस की पहचान की जा सकती है, और विशिष्ट उपचार के विकल्प उनके रोगी विशिष्ट रोग immunomodulate करने की क्षमता का आकलन करने के लिए पूर्व vivo परीक्षण किया जा सकता प्रक्रिया.

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Protocol

सभी तरीकों यहां वर्णित कोलोराडो कोलोराडो विश्वविद्यालय के एकाधिक संस्थागत समीक्षा बोर्ड (COMIRB) द्वारा अनुमोदित किया गया है । सभी वर्णित प्रक्रियाओं के नीचे एक बाँझ ऊतक संस्कृति हूड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए जब तक अंयथा कहा, फ़िल्टर्ड पिपेट युक्तियों के साथ, और सभी reफ़िल्टर्ड एजेंट ।

1. परिधीय पूरे रक्त प्रसंस्करण के लिए रिएजेंट की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार lyophilized में DMSO रिएजेंट को कमजोर करके 10 mM पर (-८० ° c) पर ruxolitinib स्टॉक aliquots (एकल उपयोग के लिए 10-15 μL/शीशी) तैयार करें । ०.२% से नीचे उत्तेजित नियंत्रण सहित सभी परख में DMSO सांद्रता रखें (vol/
  2. तैयार R848 (resiquimod) स्टॉक aliquots (10 – 15 μL/शीशी एकल उपयोग के लिए) पर 1 μg/μL द्वारा कमजोर lyophilized में बाँझ पानी में प्रति निर्माता के निर्देशों के रूप में । पर स्टोर-८० ° c ।
  3. तैयार lipopolysaccharide (एलपीएस) स्टॉक aliquots (एक बार उपयोग के लिए 5 μL प्रति शीशी केवल) पर 1 μg/μL द्वारा कमजोर lyophilized में बाँझ पानी में निर्माता निर्देश के अनुसार । पर स्टोर-८० ° c ।
  4. पंजाब, ०.५% BSA, और ०.०२% नण य का उपयोग करते हुए सेल धुंधला मीडिया (CSM) तैयार करें ।
  5. मोल और प्रोटीन परिवहन अवरोधक (पीटीआई) कॉकटेल (सामग्री की तालिका) को तैयार रखें ।
  6. गल और बाँझ पंजाबियों (1 मिमी) में ruxolitinib स्टॉक शीशी (10 मिमी) 1:10 पतला । एक ऊतक संस्कृति हूड में कमरे के तापमान पर अलग सेट करें ।
  7. गल और R848 स्टॉक शीशी (1 μg/µ एल) 1:10 बाँझ पंजाबियों (०.१ μg/µ एल) में पतला । एक ऊतक संस्कृति हूड में कमरे के तापमान पर अलग सेट करें ।
  8. गल और एलपीएस स्टॉक शीशी (1 μg/µ एल) 1:100 बाँझ पंजाबियों (०.०१ μg/µ एल) में पतला । एक ऊतक संस्कृति हूड में कमरे के तापमान पर अलग सेट करें ।
  9. पूर्व गर्म बाँझ RPMI (कोई एल-glutamine) में एक मानक ३७ ° c पानी स्नान (कम से कम 10 मिनट के लिए).
  10. पतला लाइसे/फिक्स बफर 1:5 द्वारा फ़िल्टर्ड ddH में2हे (काम एकाग्रता) benchtop पर (बाँझ होने की जरूरत नहीं है).
    नोट: पूरे रक्त की 1 मिलीलीटर लाइसे के काम एकाग्रता के 20 मिलीलीटर की आवश्यकता है/
    1. लाइसे/फिक्स बफर की 5 शर्तों के लिए पूरे खून की 1 मिलीलीटर प्रत्येक (कम से १०० मिलीलीटर) । Aliquot लाइसे/फिक्स बफर के कार्य एकाग्रता के 20 मिलीलीटर पूरे रक्त की milliliter प्रति ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में (लाइसे/फिक्स समाधान ३७ डिग्री सेल्सियस पर आवश्यक जब तक रखें) । इस प्रकार के रूप में लाइसे/फिक्स बफर युक्त शंकु ट्यूबों पर शर्तों लेबल: टी0 (समय शून्य), T6 + 5R (समय 6 ज के साथ 5 उम ruxolitinib), T6 + R848 (समय 6 ज के साथ 1 μg/एमएल R848), T6 + एलपीएस (समय 6 ज के साथ ०.१ μg/एमएल एलपीएस), T6 (समय 6 ज) ।
  11. लेबल दौर नीचे बाँझ टोपियां के साथ polystyrene ट्यूबों और 1 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के साथ एक ही नामकरण के रूप में चरण १.१० ।

2. उत्तेजना और परिधीय पूरे रक्त की प्रोसेसिंग (चित्रा 1)

  1. एक रैक पर कदम १.११ (टी0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + एलपीएस, T6) से लेबल दौर नीचे polystyrene ट्यूबों प्लेस ।
    नोट: सभी निंन चरणों का ट्यूब के इस प्रकार में किया जाता है जब तक अंयथा निर्दिष्ट । ट्यूब कैप जब ऊतक संस्कृति हूड और मशीन के बीच स्थानांतरित करने के लिए बांझपन बनाए रखने के ।
  2. ३७ ° c के 1 मिलीलीटर RPMI (कोई एल-glutamine) ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए जोड़ें (टी0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + एलपीएस, T6) । रक्त संग्रह ट्यूब कई बार पलटना, प्रत्येक ट्यूब के लिए पूरे खून की 1 मिलीलीटर जोड़ने, और पिपेट ऊपर और नीचे कई बार RPMI के साथ अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए (RPMI के साथ कमजोर पड़ने 6 ज गर्मी की अवधि के दौरान खून का झुरमुट रोकता है) ।
  3. 1:10 ruxolitinib के 10 μL को T6 + 5R में जोड़ें । एक P1000 पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन में ट्यूबों के रैक प्लेस और मशीन समय शुरू (टी = 0) ।
  4. टी0 नमूना निम्नानुसार प्रक्रिया ।
    1. एक लेबल शंकु ट्यूब में टी0 ट्यूब की पूरी सामग्री पिपेट ३७ डिग्री सेल्सियस काम एकाग्रता लाइसे/फिक्स बफर की 20 मिलीलीटर युक्त । सेल वसूली का अनुकूलन करने के लिए, काम एकाग्रता लाइसे के साथ ट्यूब कुल्ला/ शंकु ट्यूब पलटने से मिश्रण ।
    2. lysis और निर्धारण के लिए अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन । निंनलिखित निर्धारण, benchtop पर बाद में सभी चरणों का पालन करें । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
    3. supernatant को नहीं । आइस कोल्ड पंजाब के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड अप गोली को तोड़ने के लिए, तो शंकु एक 15 मिलीलीटर की मात्रा के लिए पंजाब भर के साथ भरें ।
    4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । supernatant को नहीं । दोहराएं पंजाबियों धो (steps 2.4.3-2.4.4) अगर छर्रों लाल कर रहे हैं । CSM के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को reसस्पेंड अप गोली तोड़ने के लिए, तो एंटीबॉडी धुंधला के लिए लेबल microcentrifuge ट्यूब (१.११ कदम) के लिए स्थानांतरण । एक स्वचालित सेल काउंटर या hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करने के लिए एक 10 µ एल नमूना ले लो ।
      नोट: चूंकि सभी कोशिकाओं को इस बिंदु पर तय कर रहे हैं, यह एक व्यवहार्यता दाग शामिल करने के लिए आवश्यक नहीं है ।
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । महाप्राण supernatant, गोली छोड़ने अवशिष्ट मात्रा के ~ ६० µ एल में । बर्फ पर इस गोली रखें जब तक अंय शर्तों से नमूने प्रसंस्करण पूरा कर लिया है ।
  5. टी = 30 मिनट में, ट्यूब रैक कदम (२.३) ऊतक संस्कृति हूड के लिए और निंनलिखित प्रदर्शन करते हैं ।
    1. ०.१ μg/μL R848 के 10 μL जोड़ें T6 + R848 । एक P1000 पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं ।
    2. ०.०१ μg/μL एलपीएस के 10 μL जोड़ें T6 + एलपीएस । एक P1000 पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं ।
    3. प्रोटीन परिवहन अवरोधक के 4 μL जोड़ें (500X पर शेयर) के लिए T6, T6 + 5R, और T6 + एलपीएस (लेकिन T6 + R848 के लिए नहीं ) और टी = 6 h. एक P1000 पिपेट हर 2 एच के साथ अच्छी तरह से मिश्रण तक के लिए मशीन के लिए नमूने वापस ।
      नोट: R848 एक endoplasmic TLR एगोनिस्ट है और इसलिए अपने लक्ष्य रिसेप्टर के लिए उपयोग के लिए अनुमति देने के लिए प्रोटीन परिवहन अवरोधक के अलावा में एक लौकिक देरी की आवश्यकता है ।
  6. टी = 2 एच में, T6 + R848 ट्यूब करने के लिए प्रोटीन परिवहन अवरोधक कॉकटेल (500X पर शेयर) के 4 μL जोड़ें । मिश्रण एक P1000 पिपेट के साथ सभी नमूनों और टी = 6 ज जब तक मशीन के लिए रैक वापस ।
  7. मिश्रण एक P1000 के साथ एक अधिक समय टी = 4 एच में नमूने ।
  8. पर टी = 6 ज, प्रक्रिया T6, T6 + एलपीएस, T6 + R848, और T6 + 5R के लिए चरण २.४ में वर्णित के रूप में रक्त नमूना ट्यूबों टी0 नमूना.
  9. एक भविष्य की तारीख पर प्रक्रिया करने के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर अवशिष्ट CSM मात्रा में सेल छर्रों स्टोर. वैकल्पिक रूप से, barcoding और भंडारण के बिना धुंधला एंटीबॉडी के लिए आगे बढ़ें ।

3. लीजड ड/फिक्स्ड रक्त कोशिकाओं के बारकोड

  1. गल लीजड ड/फिक्स्ड सेल नमूनों से-८० डिग्री सेल्सियस भंडारण धीरे बर्फ पर; 20 नमूनों की एक अधिकतम अद्वितीय बारकोड के साथ लेबल किया जा सकता है और इस प्रणाली का उपयोग कर परित । 1:10 द्वारा पंजाब के साथ 10x barcoding पर्म बफर पतला; प्रति नमूना ~ 3 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त बफ़र बनाएं ।
  2. CSM के साथ एक गैर बाँझ गर्त भरें और 1x barcoding पर्म बफर के साथ एक । ताजा गल नमूनों के लिए बर्फ ठंड CSM के 1 मिलीलीटर जोड़ें, एक पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिश्रण है, और संबंधित पूर्व लेबल के लिए स्थानांतरण क्लस्टर ट्यूबों ।
  3. किसी स्वचालित कक्ष काउंटर या hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करने के लिए 10 μL नमूना लें. सामान्य कक्ष की गणना करने के लिए 1.5 – 2 x 10 प्रत्येक क्लस्टर ट्यूब में नमूना प्रति6 कक्षों: निकालें और 2 x 106 कक्षों के ऊपर अतिरिक्त कक्षों की मात्रा छोड़ें ।
  4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ६०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ 1x barcoding पर्म बफर के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ६०० x g पर केंद्रापसारक । महाप्राण बंद supernatant.
  5. एक ही क्रम में एक रैक पर क्लस्टर ट्यूबों अप लाइन के रूप में बारकोड कुंजी पर संकेत दिया तो नमूना अपने बारकोड के साथ मेल खाता है । सेल नुकसान को कम करने के लिए पिपेट युक्तियाँ (कोई मिश्रण) के साथ सेल गोली को छूने के बिना क्लस्टर ट्यूबों में सभी नमूनों को मल्टीचैनल पिपेट द्वारा ८०० μL 1x barcoding पर्म बफर जोड़ें । एक तरफ क्लस्टर ट्यूबों के साथ रैक सेट करें ।
  6. 20-plex पीडी Barcoding किट ट्यूब स्ट्रिप्स से-20 डिग्री सेल्सियस और गल कमरे के तापमान पर हटा दें । 1x barcoding पर्म बफर के १०० μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और क्लस्टर ट्यूबों में इसी सेल के नमूनों में reसस्पैंड बारकोड मिश्रण के १२० μL हस्तांतरण ।
  7. मल्टीचैनल पिपेट द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण है ताकि व्यक्तिगत रूप से बारकोड नमूनों के बीच कोई पार-संदूषण है । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन क्लस्टर ट्यूब बारकोड कोशिकाओं लेबल करने के लिए अनुमति देने के लिए ।
  8. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ६०० x g पर केंद्रापसारक । महाप्राण को supernatant, फिर CSM के 1 मिलीलीटर में फिर से सस्पेंड कर दीजिये ।
  9. केंद्रापसारक और CSM में फिर से स्थगित ३.८ कदम के रूप में ।
    नोट: प्रत्येक नमूना अब एक अद्वितीय बारकोड के साथ लेबल है, और नमूने परित होने के लिए तैयार हैं.
  10. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ६०० x g पर केंद्रापसारक और महाप्राण supernatant । एक एकल पिपेट के साथ और एक ही टिप का उपयोग कर, एक polystyrene ट्यूब के लिए ~ 70-80 μL अवशिष्ट मात्रा में सभी सेल छर्रों हस्तांतरण. पिपेट टिप को बाहर न निकालें; इस टिप के साथ एक अलग सेट पिपेट ।
  11. एक मल्टीचैनल पिपेट और नए सुझावों के साथ, जोड़ने ~ १०० μL CSM प्रत्येक मूल क्लस्टर ट्यूब के लिए सेल वसूली को अधिकतम करने के लिए । टिप है कि एक तरफ स्थापित किया गया था के साथ एकल पिपेट के साथ, एक ही polystyrene ट्यूब के लिए ~ १०० μL अवशिष्ट मात्रा में सभी सेल छर्रों हस्तांतरण ।
  12. polystyrene ट्यूब (~ 3 एमएल) बंद शीर्ष करने के लिए CSM जोड़ें । गणना और परित बारकोड सेट के सेल संख्या रिकॉर्ड । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ६०० x g पर केंद्रापसारक और महाप्राण supernatant । एक ही दिन में बारकोड नमूने धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: यह barcoding प्रक्रिया में ~ 20 – 30% कोशिका हानि की उम्मीद करने के लिए सामान्य है.

4. बारकोड्ड लीजड ड/फिक्स्ड रक्त कोशिकाओं और जन Cytometry साधन पर विश्लेषण के लिए तैयारी का दाग

नोट: धुंधला एंटीबॉडी के प्रत्येक 1x titer (१०० μL धुंधला प्रतिक्रिया प्रति एंटीबॉडी के 1 μL), आम तौर पर 3 दाग कर सकते है-4 x 106 कोशिकाओं । इसलिए, जब सभी बारकोड नमूने एक ट्यूब में जमा हो जाते हैं, एंटीबॉडी की मात्रा को स्केल किया जाना चाहिए । यदि 20 बारकोड नमूनों की राशि के लिए 30 x 106 कोशिकाओं, और प्रत्येक 1x titer 3 दाग कर सकते हैं-4 x 106 कोशिकाओं, बारकोड नमूना केवल एक 10x titer की आवश्यकता है, के रूप में प्रत्येक नमूने को व्यक्तिगत रूप से धुंधला करने का विरोध किया, जो एंटीबॉडी की एक 20X राशि की आवश्यकता होगी (1x प्रति व्यक्तिगत ट्यूब) । कोशिका संख्या के लिए एंटीबॉडी की एकाग्रता ध्यान से प्रत्येक व्यक्ति एंटीबॉडी कॉकटेल के लिए titrated होना चाहिए (यहां चर्चा नहीं) ।

  1. सतह धुंधला और cytokine प्रेरण के लिए एंटीबॉडी (सामग्री की मेज) का उपयोग कर कोशिकाओं दाग ।
    1. जोड़ा जा करने के लिए राशि की गणना और pipetting त्रुटि के लिए लेखांकन द्वारा सतह धुंधला कॉकटेल बनाओ (यानी, यदि प्रत्येक नमूने में 2 x 106 कोशिकाओं के 20 बारकोड नमूने धुंधला, एक 10x titer दाग की आवश्यकता है; अंतिम मात्रा गणना के लिए, एक 10.5 x अंतिम धुंधला समाधान बनाने के द्वारा pipetting त्रुटि के लिए क्षतिपूर्ति) ।
    2. बारकोड सेल गोली करने के लिए सतह धुंधला मात्रा के 10x मूल्य जोड़ें । एक ही टिप, मिश्रण और सतह दाग और सेल गोली की मात्रा को मापने के साथ, कोशिका हानि को कम करने के लिए ।
    3. कोशिकाओं और धुंधला कॉकटेल की मात्रा के आधार पर, सेल नमूनों की संख्या के अनुसार ५० μL की एक अंतिम धुंधला मात्रा के लिए CSM जोड़ने (यानी, अगर 20 नमूनों का एक सेट चल रहा है, ५० μL X 20 = 1 मिलीलीटर). 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन । हर 15 मिनट के नमूने को बढ़ावा देने के लिए आंदोलन भी धुंधला ।
    4. सतह दाग गर्मी के दौरान, पर्म/धो बफर (सामग्री की तालिका) कमजोर द्वारा 1:10 फ़िल्टर्ड ddH2के साथ तैयार permeabilization के लिए 2 मिलीलीटर, और धोने के लिए 5 मिलीलीटर की मात्रा तैयार करें । 4 ° c या बर्फ पर रखें ।
    5. CSM के साथ सतह धुंधला ट्यूब से ऊपर, और 5 मिनट के लिए 4 ° c पर ६०० x g पर केंद्रापसारक महाप्राण supernatant । 4 ° c के 2 मिलीलीटर में बारकोड नमूना reसस्पेंड, 1:10 कमजोर पड़ने पर्म/ 20 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन-30 मिनट के लिए पूरी तरह से permeabilize कोशिकाओं ।
    6. 5 मिनट के लिए 4 ° c पर ६०० x g पर केंद्रापसारक और महाप्राण supernatant ।
    7. intracellular धुंधला के लिए, समान धुंधला कदम (सतह धुंधला के लिए के रूप में) का पालन करें । हालांकि, का उपयोग करें 4 ° c, 1:10 कमजोर पड़ने पर्म/CSM के बजाय बफ़र कुल धुंधला मात्रा बनाने के लिए ताकि कोशिकाओं intracellular धुंधला भर में एक permeabilizing वातावरण में रहते हैं ।
    8. सतह सना हुआ और permeabilized सेल गोली (कदम 4.1.2-4.1.17) के लिए intracellular एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें । सेल नमूनों की संख्या प्रति ५० μL के लिए कुल धुंधला मात्रा लाओ । 4 डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए मशीन । हर 15 मिनट के नमूने को भी धुंधला सुनिश्चित करने के लिए आंदोलन ।
    9. intracellular दाग के दौरान, intercalator समाधान तैयार करें: ९०० फ़िल्टर किए गए पंजाबियों के μL + १०० μL की फ़िल्टर 16% पीएफए (अंतिम एकाग्रता १.६% पीएफए) + ०.२ μL की ५०० उम के intercalator डाई (सामग्री तालिका) ।
    10. सेल गोली से ऊपर + intracellular ठंड 1:10 पर्म के साथ एंटीबॉडी कॉकटेल/
    11. 5 मिनट के लिए 4 ° c पर ६०० x g पर केंद्रापसारक, और महाप्राण supernatant । CSM के साथ धुंधला ट्यूब शीर्ष बंद । गणना और सेल संख्या रिकॉर्ड । 5 मिनट के लिए 4 ° c पर ६०० x g पर केंद्रापसारक, और महाप्राण supernatant । ४.९ चरण से intercalator समाधान के 1 मिलीलीटर में कक्षों को पुनर्स्थगित । पूर्ण intercalation, या रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस (intercalator समाधान में नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह के लिए उंहें जन cytometry साधन पर चलने से पहले के लिए रह सकते है के लिए कमरे के तापमान पर कम से कम 20 मिनट के लिए मशीन) ।
  2. मास cytometry यंत्र के लिए कोशिकाएँ तैयार करें.
    1. फ़िल्टर्ड ddH2ओ के 3 मिलीलीटर के साथ ट्यूब से ऊपर, और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ६०० x g पर केंद्रापसारक । फ़िल्टर्ड ddH2के 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड ओ. एक १०० माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से इस निलंबन दर्रा किसी भी मलबे या समुच्चय है कि संभावित जन cytometry साधन को रोकना सकता हटाने के लिए ।
    2. गिनती और सेल संख्या के बाद निस्पंदन रिकॉर्ड । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ६०० x g पर केंद्रापसारक
  3. कमजोर द्वारा अंशांकन मनका समाधान (सामग्री तालिका) तैयार करें यह 1:10 फ़िल्टर्ड ddH2ओ में ।
  4. 1:10 की आवश्यक मात्रा में सना हुआ कोशिकाओं reसस्पेंड ~ 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के एक सेल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पतला अंशांकन मनका समाधान ।
    नोट: ४५ µ l/मिनट पर एक CyTOF1 के लिए, अनुशंसित इष्टतम है 5 x 105 कोशिकाओं/ 30 µ l/मिनट पर Helios के लिए, ७.५ x 105 कोशिकाओं/
  5. मास cytometry साधन9पर नमूना चलाने के लिए आगे बढ़ें ।

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Representative Results

चित्रा 1 रक्त नमूना aliquots, उत्तेजना एजेंटों के अलावा के समय, प्रोटीन परिवहन अवरोधक कॉकटेल, और मशीन के आबंटन सहित परिधीय रक्त के नमूनों की उत्तेजना और प्रसंस्करण के लिए कार्यप्रवाह को दर्शाता है समय तक लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis और निर्धारण. उत्तेजक एजेंटों की पसंद संकेतन और cytokine मार्ग है कि आकलन के लिए लक्षित कर रहे है पर निर्भर करेगा । उदाहरण के लिए, यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, TLR एगोनिस्ट एकाधिक कक्ष प्रकारों में जन्मजात प्रतिरक्षा संवेदन तंत्र का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रतिनिधि extracellular (एलपीएस, TLR4 एगोनिस्ट) और endoplasmic (R848, TLR7/8 एगोनिस्ट) एगोनिस्ट को चुना गया । अंय उत्तेजक एजेंटों Phorbol 12-Myristate 13-एसीटेट (पमा) और Ionomycin (PMAIONO) है, जो टी सेल उत्प्रेरक के रूप में कार्य कर सकते है शामिल हैं । विशिष्ट साइटोकिंस भी उत्तेजक एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ अंय विशिष्ट बी और टी सेल एंटीजन ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण को प्रदर्शित करने के लिए, चित्रा 2, चित्रा 3, और चित्रा 4 दिखाएँ प्रतिनिधि परिणाम उत्तेजक स्थितियों के रूप में एलपीएस, R848, और PMAIONO का उपयोग कर प्राप्त की. जबकि PMAIONO का उपयोग प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं किया गया था, डेटा चित्रा 3 और चित्रा 4 में दिखाया गया है कि अलग (और चयनात्मक) सेल प्रकार और साइटोकिंस सक्रिय है/TLR एगोनिस्ट (एलपीएस और R848) एक टी बनाम के जवाब में प्रेरित कर रहे है सेल उत्प्रेरक (PMAIONO) । यह देखते हुए कि 26 सतह मार्करों (सामग्री तालिका) demarcate करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कई जंमजात और अनुकूली प्रतिरक्षा सेल सबसेट, विभिंन टी, बी, NK, monocyte, और वृक्ष सेल सबसेट एक साथ एक ही नमूने के भीतर अध्ययन किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण के मार्कर भी शामिल हैं, जैसे CD86 या ICOS बी कोशिकाओं और PD1 के लिए टी कोशिकाओं के लिए. एक प्रतिनिधि सीमित गेटिंग CD14hi monocytes के आकलन का प्रदर्शन रणनीति चित्रा 2में दिखाया गया है । हालांकि, आगे विस्तृत और विस्तार गेटिंग टी, बी, NK, monocyte, वृक्ष, और granulocytic सेल सबसेट O'Gorman और Hsieh एट अल में हमारे पहले प्रकाशित काम में पाया जा सकता है और O'Gorman और कांग एट अल । 14 , 15 इसके अतिरिक्त, (और सीमित नहीं करने के लिए) सहित unपर्यवेक्षित विश्लेषण तरीकों कुदाल16, वइसने17, खट्टे18, Phenograph19, और Xshift20 मास cytometry डेटा का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (नहीं यहां चर्चा) । प्रतिनिधि के रूप में CD14hi monocytes और CD4 टी कोशिकाओं का उपयोग सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा सेल सबसेट, इन सेल प्रकार के भीतर cytokine प्रेरण प्रदर्शन डेटा चित्रा 3में दिखाया गया है । साइटोकिंस की एक संख्या का चयन करने के लिए चुना गया था कि R848 चुनिंदा IL-12 लाती है (p40 उपइकाई) और CD14hi monocytes में MCP1 जबकि एलपीएस (चित्रा 3) नहीं है । PMAIONO, एक शक्तिशाली टी सेल उत्प्रेरक CD14hi monocytes (चित्रा 3) में साइटोकिंस प्रेरित नहीं करता है, लेकिन इंटरफेरॉन गामा (IFNγ) और ट्यूमर परिगलन कारक TNFα टी कोशिकाओं (चित्रा 4) में अल्फा (CD4) प्रेरित करता है । परिधीय रक्त नमूना उत्तेजना और प्रसंस्करण में सफल तकनीक cytokine प्रेरण के पैटर्न को प्रदर्शित करेगा उत्तेजक स्थितियों और प्रतिरक्षा सबसेट के लिए विशिष्ट, के रूप में चित्रा 3 और चित्रा 4में उदाहरण । 14 साइटोकिंस के पूर्ण विश्लेषण के लिए यहां वर्णित कक्ष प्रकार में 26 सतह मार्करों के भीतर कब्जा कर लिया, कृपया देखें O'Gorman और Hsieh एट अल., और O'Gorman और कांग एट अल । 14 , 15

कैसे प्रयोगात्मक दृष्टिकोण इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रदर्शित करने के लिए "आंतरिक" एक प्रणालीगत स्व-प्रतिरक्षित रोग के रोगजनक राज्य कब्जा जैसे SLE में जब एक स्वस्थ दाता की तुलना में, चित्रा 5 cytokine प्रेरण दिखाता है (Mip1β और MCP1) में CD14hi monocytes में पाए जाने वाले रोगग्रस्त परिधीय रक्त के नमूने केवल (भाग ख), किसी भी exogenous उत्तेजना (T6 की तुलना टी0) के अभाव में. इन साइटोकिंस में JAK अवरोधक चिकित्सा ruxolitinib (T6 + 5R की तुलना में T6) के रोगग्रस्त परिधीय रक्त के नमूने केवल (भाग ख) द्वारा संग्राहक/

Figure 1
चित्र 1. उत्तेजना और परिधीय रक्त के प्रसंस्करण के लिए जन cytometry विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह । आरबीसी lysis और रोग परिधीय रक्त का नमूना तुरंत निंनलिखित संग्रह (टी0) के निर्धारण के लिए प्रोटोकॉल, या ३७ डिग्री सेल्सियस पर 6 एच की मशीन के बाद किसी भी exogenous एजेंट (T6), या एलपीएस के साथ (T6 + एलपीएस), R848 (T6 + R848 के अभाव में एक प्रोटीन परिवहन अवरोधक (पीटीआई) के साथ; प्रोटीन परिवहन अवरोधक के लिए 4 ज केवल), या ruxolitinib (T6 + 5R) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. CD14hi monocytes की पहचान के लिए प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति । निंनलिखित निर्धारण और आरबीसी lysis, व्यक्तिगत लीजड ड/एक स्वस्थ दाता से फिक्स्ड सेल नमूने, सतह मार्करों, permeabilized और साइटोकिंस (सामग्री की तालिका) के खिलाफ 14 एंटीबॉडी के साथ दाग के खिलाफ 26 एंटीबॉडी के साथ लेबल, बारकोड थे । CD14hi monocytes की पहचान का प्रतिनिधित्व करने वाली सीमित गेटिंग कार्यनीति को दर्शाया गया है. बाएं से दाएं, प्रत्येक 2d भूखंड का प्रतिनिधित्व माता पिता की आबादी से एक जनसंख्या सबसेट है कि gated है (नीले बॉक्स) 2d भूखंड से तुरंत छोड़ दिया है । एक विस्तारित गेटिंग रणनीति O'Gorman और Hsieh एट अलमें पाया जा सकता है, और O'Gorman और कांग एट अल । 14 , 15 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. एलपीएस, R848, और PMAIONO के साथ उत्तेजना के बाद CD14hi monocytes में cytokine प्रेरण का उदाहरण । समय पर एक स्वस्थ दाता से परिधीय रक्त के नमूनों का एक प्रतिनिधि जन cytometry विश्लेषण शूंय (टी0), उत्तेजित (T6), और एलपीएस के साथ उत्तेजना के बाद (T6 + एलपीएस), R848 (T6 + R848), और PMAIONO (T6 + PMAIONO) दिखाया गया है । CD14hi monocytes में cytokine प्रेरण का एक उदाहरण दिखाया गया है; चयनित उत्तेजक एजेंट (TLR एगोनिस्ट बनाम टी सेल उत्प्रेरक) का उपयोग करने के लिए विशिष्टता के साथ साइटोकिंस चित्रित कर रहे हैं । कई प्रतिरक्षा सेल उपसेट भर में सभी cytokine प्रेरण के लिए विस्तारित डेटा इस मास cytometry एंटीबॉडी पैनल के साथ पता लगाया O'Gorman और Hsieh एट अलमें पाया जा सकता है, और O'Gorman और कांग एट अल । 14 , 15 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. CD4 टी कोशिकाओं में cytokine प्रेरण का उदाहरण एलपीएस, R848, और PMAIONO के साथ उत्तेजना के बाद । समय पर एक स्वस्थ दाता से परिधीय रक्त के नमूनों का एक प्रतिनिधि जन cytometry विश्लेषण शूंय (टी0), उत्तेजित (T6), और एलपीएस के साथ उत्तेजना के बाद (T6 + एलपीएस), R848 (T6 + R848), और PMAIONO (T6 + PMAIONO) दिखाया गया है । CD4 टी कोशिकाओं में cytokine प्रेरण का उदाहरण दिखाया गया है; चयनित उत्तेजक एजेंट (TLR एगोनिस्ट बनाम टी सेल उत्प्रेरक) का उपयोग करने के लिए विशिष्टता के साथ साइटोकिंस चित्रित कर रहे हैं । कई प्रतिरक्षा सेल उपसेट भर में सभी cytokine प्रेरण के लिए विस्तारित डेटा इस मास cytometry एंटीबॉडी पैनल के साथ पता लगाया O'Gorman और Hsieh एट अलमें पाया जा सकता है, और O'Gorman और कांग एट अल । 14 , 15 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. SLE रोग रोगी से CD14hi monocytes में cytokine प्रेरण का उदाहरण. स्वस्थ दाता (क) और SLE रोग रोगी (ख) से परिधीय रक्त नमूनों का एक प्रतिनिधि जन cytometry विश्लेषण दिखाया गया है. CD14hi monocytes में cytokine प्रेरण के उदाहरण; SLE रोग के लिए विशिष्टता के साथ चयनित साइटोकिंस "आंतरिक" रोगजनक प्रक्रिया (T6) (यानी, MIP1β और MCP1 के केवल SLE रोगी में प्रेरण), और immunomodulator ruxolitinib (T6 + 5R) के प्रभाव को दर्शाया गया है । इस मास cytometry एंटीबॉडी पैनल के साथ पता लगाया कई प्रतिरक्षा सेल उपसेट भर में सभी cytokine प्रेरण के लिए विस्तारित डेटा O'Gorman और कांग एट अल में पाया जा सकता है । 15 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां हम एक उपंयास, एकल सेल, proteomic दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए एक साथ कई प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार का आकलन और रोगी विशिष्ट "रोगजनक" परिधीय रक्त प्लाज्मा परिसंचारी कारकों के वातावरण में उनके विभिंन cytokine perturbations का पता लगाने । इस विधि विश्लेषणात्मक वाहन के रूप में परिधीय पूरे रक्त को रोजगार, और जन cytometry प्रतिरक्षा सेलुलर phenotypic और कार्यात्मक विषमताओं के मूल्यांकन के लिए उपकरण के रूप में. विधि मानव और चूहों21अध्ययन करने के लिए आसानी से लागू है, और इस तरह के संकेत असामान्यताओं14का पता लगाने के रूप में अन्य प्रतिरक्षा कार्यात्मक विश्लेषण के साथ संगत है.

उपयोगकर्ता चर की एक संख्या है कि इस प्रक्रिया की सफलता को प्रभावित कर सकते है जानकार होना चाहिए । हमारे अनुभव के आधार पर, रक्त के नमूनों intracellular साइटोकिंस की आधारभूत प्रेरण से बचने के लिए संग्रह के 2 ज के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए (डेटा नहीं दिखाया गया है). रक्त के नमूनों को कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर रहना चाहिए, जबकि प्रसंस्करण का इंतजार है । रक्त के नमूनों या तो सोडियम हेपरिन या EDTA ट्यूबों में एकत्र किया जा सकता है, वर्णित परख के साथ हस्तक्षेप के बिना । जीते और मृत कोशिका भेदभाव सिस्प्लैटिन22का उपयोग कर मास cytometry द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । हालांकि, इस तरह के मूल्यांकन के ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में छोड़ा जाता है रक्त संभालने के तुरंत कार्रवाई की है (या 2 एच के भीतर) संग्रह के बाद । इसके अतिरिक्त, भले ही नमूनों के प्रसंस्करण में देरी हो गई, cryopreservation की कमी के लिए अनुमति देता है जीने/ हम तथापि, किसी भी अध्ययन में जो कोशिका मृत्यु बहाव विश्लेषण के परिणाम को प्रभावित कर सकता है के लिए व्यवहार्यता भेदभाव के लिए सिस्प्लैटिन के उपयोग की सिफारिश करेंगे ।

इसके अलावा, हमने पाया है कि सावधान पसंद और उत्तेजक एजेंट के अनुमापन लक्षित प्रतिरक्षा मार्ग का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है/cytokine प्रेरण । सबसे पहले, उत्तेजक एजेंट की पसंद 1 पर आधारित होना चाहिए) प्रतिरक्षा मार्ग को संलग्न करने का इरादा/मूल्यांकन, और 2) लक्षित कार्यात्मक readouts (चाहे संकेत प्रोटीन या cytokine उत्पादन) । उदाहरण के लिए, यदि लक्ष्य टी सेल सक्रियकरण और विभिंन टी हेल्पर सेल (गु) सबसेट और उनके संबंधित cytokine प्रेरण, PMAIONO या विरोधी CD3/विरोधी CD28 का एक संयोजन का मूल्यांकन किया गया एक उपयुक्त उत्तेजक हालत होगी । हालांकि, यदि लक्ष्य monocyte सबसेट सक्रियण का मूल्यांकन करने के लिए थे, एक TLR एगोनिस्ट (या उनमें से एक संयोजन) सबसे अच्छा हो सकता है । दूसरा, इन उत्तेजक एजेंटों में से प्रत्येक के लिए एकाग्रता के लिए सेल सक्रियण और cytokine प्रेरण, गंभीर रूप से सेल की सतह मार्करों फेरबदल के बिना करने के लिए अनुकूलित करने की जरूरत है । बहुत कम उत्तेजक एजेंट का उपयोग करें वांछित सेल प्रकार के सक्रियकरण के लिए नेतृत्व नहीं करेंगे और कोई cytokine प्रेरण मनाया जाएगा, जबकि बहुत अधिक का उपयोग अत्यधिक कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व करेंगे, और प्रतिरक्षा सेल सतह मार्करों में परिवर्तन ऐसी है कि आबादी की पहचान उत्तेजित हालत में उत्तेजित हालत में उपस्थित नहीं हो सकेंगे. तीसरा, उत्तेजना के कैनेटीक्स भी एक महत्वपूर्ण चर है । जबकि 6 h पहले एक इष्टतम उत्तेजना समय सीमा के रूप में प्रकाशित किया गया है के लिए समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस के अधिकतम प्रेरण TLR उत्तेजना14,23, एक अलग उत्तेजना timepoint के जवाब में कब्जा करने के लिए आवश्यक हो सकता है अंय एजेंटों । इसी तरह, परिधीय रक्त के नमूनों के साथ इन विट्रो में किसी भी चिकित्सीय दवा का उपयोग भी उत्तेजक एजेंट के रूप में एक ही तरीके से titrated किया जाना चाहिए, जबकि एकाग्रता और timepoint करने के लिए करीब ध्यान दे.

इस प्रोटोकॉल में, हम ताजा परिधीय पूरे रक्त के नमूनों का उपयोग करें, intracellular cytokine प्रेरण (और पता लगाने) के रूप में cryopreserved नमूनों की तुलना में अधिक मजबूत और प्रभावी है. हम प्रोटोकॉल में वर्णन यहां पूरे रक्त के उपयोग के रूप में PBMCs का विरोध किया, प्लाज्मा परिसंचारी कारकों की उपस्थिति के रूप में प्रतिरक्षा रोग प्रक्रिया से संबंधित विषमताओं के "आंतरिक" प्रकृति के लिए योगदान देता है । इन प्लाज्मा परिसंचारी कारकों उत्तेजक स्थितियों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं परिधीय पूरे रक्त में जोड़ा, जैसे विरोधी के अलावा-आईजीएम और विरोधी आईजीजी बी सेल रिसेप्टर संलग्न करने के लिए, के रूप में वे प्लाज्मा घूम एंटीबॉडी और लाल रक्त कोशिकाओं से बंधे हैं. इसलिए, उत्तेजक स्थितियों के सावधान पसंद जब परिधीय पूरे रक्त का उपयोग सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है पढ़ें बहिष्कार । परिधीय पूरे रक्त का उपयोग (vivo मंचमें ) और नुकसान (प्लाज्मा परिचालित कारकों हस्तक्षेप) अपने फायदे हैं । हालांकि, PBMCs "पेशेवरों" और "विपक्ष" का एक अलग सेट प्रदान करते हैं । जब ताजा PBMCs (के रूप में पूरे खून का विरोध किया) एक ही प्रक्रिया से गुजरना/प्रोटोकॉल और उत्तेजना के साथ अलग TLR एजेंटों का उपयोग कर, हम एक ही cytokine प्रेरण के "पैटर्न" मनाया, हालांकि एक थोड़ा कम परिमाण14,23। इस प्रोटोकॉल के बाद, जमे हुए PBMCs के उपयोग के लिए एक कम मजबूत cytokine प्रेरण की ओर जाता है, और इसलिए हम सीधे नमूनों से परिणामों की तुलना के खिलाफ सिफारिश करेंगे उन ताजा संसाधित के साथ cryopreservation के बाद संसाधित ।

ताजा बनाम जमे हुए नमूनों की चेतावनी को देखते हुए, और इष्टतम डेटा की गुणवत्ता के लिए ताजा नमूनों के उपयोग के लिए वरीयता, यहां वर्णित प्रोटोकॉल भावी मानव अध्ययन के लिए उपयुक्त है, जहां रोगी नमूने महीने की एक समय सीमा से अधिक वर्षों के लिए एकत्र कर रहे हैं । परिधीय रक्त के नमूनों के रूप में वर्णित संसाधित किया जा सकता है, और एक बार वे आरबीसी lysis और निर्धारण चरण तक पहुँचने, नमूनों में संग्रहीत किया जा सकता-८० ° c और बाद में बैचों में दाग. इस तकनीकी दृष्टिकोण, जबकि सबसे अधिक मानव अध्ययन के लिए लाभप्रद, भी एंटीबॉडी कि निर्धारण के बाद लक्ष्य epitope को बांध कर सकते है का उपयोग करने की चुनौती बन गया है । सामग्री की तालिका संबंधित एंटीबॉडी है कि परीक्षण किया गया है और विशिष्ट धुंधला पद निर्धारण के प्रदर्शन के लिए क्लोन सूचीबद्ध करता है । Barcoding एकाधिक नमूनों की (n = 20) के लाभ प्रदान करता है 1) तकनीकी परिवर्तनशीलता में कमी आई, के रूप में कई नमूने एक ट्यूब में एक साथ दाग रहे हैं, इसलिए काफी सुसंगत और विश्वसनीय शर्तों के पार नमूनों की तुलना कर; 2) कुल एंटीबॉडी उपयोग की कमी (देखें प्रोटोकॉल अनुभाग ४.१); और 3) की barcoding योजना "6 अलग पैलेडियम आइसोटोप/दोहरी के अपवर्जन (कोशिकाओं से अधिक 4 पैलेडियम आइसोटोप के लिए सकारात्मक) की ओर जाता है । ये फायदे Zunder और फिक एट अल में विस्तार से चर्चा कर रहे हैं । 24 इसके अतिरिक्त, barcoding प्रक्रिया की आवश्यकता है कि कोशिकाओं को ठीक किया जाना है, के रूप में वे हल्का barcoding (पैलेडियम आइसोटोप)24के intercalation के लिए permeabilized की जरूरत है । इसलिए, लाइव धुंधला इस प्रोटोकॉल का पालन नहीं किया जा सकता है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि लाइव सेल barcoding (के रूप में तय की सेल barcoding के खिलाफ यहां वर्णित) एक संभावना25,26है, लेकिन यहां प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को तय कर रहे है ताकि वे संग्रहीत किया जा सकता है और एक साथ संसाधित बैच ।

बैच नमूना प्रसंस्करण, जबकि एक परिश्रम और समय दक्षता दृष्टिकोण से लाभप्रद भी अपनी चुनौतियों का है । बैच प्रसंस्करण के साथ एक सावधानी से उपचारात्मक सामान्य प्रक्रिया के लिए एक की जरूरत है । यह सामान्यीकरण प्रक्रिया जन cytometry कार्यप्रवाह के विभिन्न चरणों में संबोधित किया जा सकता है । सबसे पहले, कक्ष संख्या में एंटीबॉडी की एकाग्रता बैचों भर में लगातार रखा जाना चाहिए । हमने पाया है कि एक प्रभावी तरीका है इस सुसंगत एकाग्रता को प्राप्त करने के द्वारा 1) सावधान अनुमापन एंटीबॉडी एकाग्रता के सेल संख्या के लिए, और 2) नमूने है कि एक साथ बारकोड रहे है की सेल संख्या के मानकीकरण (यानी, १,०००,००० प्रति नमूना कक्ष, सभी 20 बारकोड नमूनों के लिए). दूसरा, साधन के लिए संकेत तीव्रता परिवर्तनशीलता (ट्यूनिंग, अंशांकन, और चलाने के समय पर संकेत क्षय के विभिंन दिनों) के लिए खाते में, नमूनों reसस्पैंड किया जाना चाहिए और एक उचित मानकीकरण मनका समाधान के साथ बड़े पैमाने पर cytometer पर विश्लेषण (तालिका सामग्री के), (लेकिन पहले debarcoding करने के लिए) डेटा अधिग्रहण के बाद फ़ाइल सामांयीकरण द्वारा पीछा किया । व्यक्तिगत नमूनों पूरे बारकोड फ़ाइल के बाद Zunder और Finck एट अल में वर्णित उपकरणों का उपयोग कर सामान्यीकृत किया गया है के बाद कर रहे हैं । 24 तीसरा, मैनुअल एंटीबॉडी धुंधला तकनीकी परिवर्तनशीलता के लिए खाते में, हम प्रत्येक बारकोड सेट है कि एक ही अध्ययन के लिए विश्लेषण किया जाता है के साथ एक "लंगर" नमूने के शामिल किए जाने की सिफारिश, यानी, एक ही नमूना है कि एक दाता से है (मानव अध्ययन) और उसी तरह अन्य अध्ययन के नमूने लेकर कार्रवाई की गई है । यह नमूना एक बार बड़े पर्याप्त मात्रा में प्रत्येक बारकोड अध्ययन के लिए विश्लेषण सेट में वितरित किया जा करने के लिए उत्पंन किया जाना चाहिए । प्रत्येक बारकोड से इन लंगर नमूने कि बारकोड के लिए अध्ययन के नमूने भर में संकेत परिवर्तनशीलता के लिए सही करने के लिए विचरण का एक गुणांक उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा (यानी, बारकोड 8 से लंगर नमूना 8 बारकोड में परिवर्तनशीलता के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा) ।

एक अंय महत्वपूर्ण अनुकूलन कदम मास cytometry एंटीबॉडी पैनल, जो प्रासंगिक प्रतिरक्षा सेल सबसेट और साइटोकिंस का आकलन करेंगे के विधानसभा है । एंटीबॉडी पैनल विधानसभा में प्रमुख चर के कुछ क्लोन (ऊपर संबोधित) के विकल्प शामिल हैं, एंटीबॉडी titer ंयूनतम पृष्ठभूमि संकेत, एंटीबॉडी लक्ष्यों और आइसोटोप चैनल प्रतिजन बहुतायत और चैनल संवेदनशीलता के आधार पर पसंद के लिए, " मुआवजा "का संकेत spillover आइसोटोप नापाक और ऑक्सीकरण पर आधारित है, और व्यक्तिगत एंटीबॉडी बहुत परिवर्तनशीलता. इन ऑप्टिमाइज़ेशन चरणों28 कहीं और यहां वर्णित प्रोटोकॉल के क्षेत्र के भीतर नहीं संबोधित कर रहे हैं ।

परिधीय रक्त के नमूनों में प्रतिरक्षा विषमताओं का अध्ययन करने के लिए इस एकल सेल proteomic दृष्टिकोण का उपयोग करना, यह प्रतिरक्षा सेल सबसेट के असामान्य phenotypes की पहचान करने के लिए संभव है, चाहे वह जनसंख्या आवृत्ति मतभेद या की अभिव्यक्ति में परिवर्तन है विशिष्ट कक्ष सरफ़ेस मार्कर (जैसे सेल सक्रियण के मार्कर) । इसके अतिरिक्त, यह भी प्रतिरक्षा कोशिका उपसमुच्चय के भीतर कार्यात्मक असामान्यताओं की पहचान करने के लिए संभव है, जैसे या साइटोकिंस का अधिक उत्पादन. अंत में, नमूने की तुलना की प्रक्रिया तुरंत तय (टी0) बनाम एक exogenous एजेंट (T6) के बिना मशीन के 6 ज के बाद तय "आंतरिक" रोगजनक प्रक्रियाओं है कि प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार और cytokine विषमता (T6-टी0) के लिए नेतृत्व का प्रदर्शन करता है । इस दृष्टिकोण प्रणालीगत प्रतिरक्षा मध्यस्थता प्रक्रियाओं की एक किस्म के अध्ययन के अनुरूप हो सकता है, और उत्तेजना एजेंट के आधार पर कई प्रतिरक्षा सेल सबसेट और रास्ते की सगाई ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उसे बौद्धिक इनपुट और उपयोगी टिप्पणी के लिए Aimee Pugh-बर्नार्ड शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम Boettcher फाउंडेशन वेब-Waring बायोमेडिकल रिसर्च अवार्ड और पुरस्कार संख्या K23-1K23AR070897 NIH से ऐलेना W.Y. Hsieh को समर्थन किया गया था । वह भी पुरस्कार संख्या K12 द्वारा समर्थित किया गया था-HD000850 Eunice कैनेडी श्राइवर राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान और Lucile पैकार्ड फाउंडेशन बच्चों के स्वास्थ्य, स्टैनफोर्ड CTSA UL1 TR001085, और बाल स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए इंस्टीट्यूट ऑफ स्टैनफोर्ड यूनिवर्सिटी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ruxolitinib Santa Cruz SC-364729A Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 μM
R848 Invivogen tlrl-r848-5 Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 1 μg/mL
LPS-EK Invivogen tlrl-eklps Stock Conc: 1 μg/μL; Final Conc: 0.1 μg/mL
Sterile PBS Lonza 17-516F
Lyse/Fix Buffer BD biosciences 558049 Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (dilute in ddH2O)
BD Phosflow perm/wash buffer I BD biosciences 557885 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (dilute in ddH2O)
RPMI Gibco 21870-076
Sodium Azide (NaN3) Sigma-Aldrich S-8032 Stock Conc: >99.9%; Final Conc: 0.0002
Protein Transport Inhibitor (PTI) eBiosciences 00-4980-93 Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X
DNA Intercalator Fluidigm 201192B Stock Conc: 500 μM; Final Conc: 0.1 μM
Cell Staining Media (CSM) PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3
MaxPar Barcode Perm Buffer Fluidigm 201057 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
20-plex Pd Barcode Set Fluidigm S0014 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
EQ TM Four Element Calibration Beads Fluidigm 201078 Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X
16% MeOH-free Formaldehyde Solution Thermo 28908 Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1.6% (w/v)
Sterile round bottom polystyrene tubes VWR 60818-496 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Polypropylene cluster tubes Light Labs A-9001 Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a
Helios CyTOF instrument Fluidigm Helios All solutions to be used in CyTOF analysis need to be free of metal contamination. ddH2O is used in the preparation of any solutions should have a resistivity of at least 18.0 MΩ.cm. ddH2O and any self-prepared solutions should be stored in new plastic or glass bottles that have never been autoclaved.
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies used for Mass Cytometry
Surface markers
CD1c Biolegend L161 Mass: 161
CD3 BD UCHT1 Mass: 144
CD4 Biolegend SK3 Mass: 174
CD7 BD M-T701 Mass: 149
CD8 Biolegend SK1 Mass: 142
CD11b Fluidigm ICRF44 Mass: 209
CD11c BD B-ly6 Mass: 152
CD15 BD HI98 Mass: 115
CD14 Biolegend M5E2 Mass: 154
CD16 eBioscience/Thermo B73.1 Mass: 165
CD19 Santa Cruz SJ25C1 Mass: 163
CD21 Biolegend Bu32 Mass: 141
CD27 BD L128 Mass: 155
CD38 Fluidigm HIT2 Mass: 172
CD45 total Biolegend HI30 Mass: 89
CD45RA Biolegend HI100 Mass: 153
CD56 Miltenyi REA196 Mass: 168
CD66 BD B1.1/CD66 Mass: 113
CD86 Fluidigm IT2.2 Mass: 150
CD123 Fluidigm 6H6 Mass: 143
CD278/ICOS Biolegend C398.4A Mass: 156
CD179/PD1 Biolegend EH12.2H7 Mass: 162
IgD Biolegend IA6-2 Mass: 146
IgM Biolegend MHM-88 Mass: 151
CXCR5 BD RF8B2 Mass: 173
HLADR Biolegend L243 Mass: 167
Cytokines
IL-1α Biolegend 364-3B3-14 Mass: 147
IL-1β Biolegend  H1b-98 Mass: 169
IL-1RA Santa Cruz  AS17 Mass: 157
IL-6 Biolegend MQ2-13A5 Mass: 164
IL-8 BD E8N1 Mass: 160
IL-12/IL-23p40 Biolegend  C8.6 Mass: 171
IL-17A Biolegend  BL168 Mass: 148
IL23p19 eBioscience/Thermo 23dcdp Mass: 176
MIP1β BD D21-1351 Mass: 158
MCP1 BD 5D3-F7 Mass: 170
IFNα Miltenyi  LT27:295 Mass: 175
IFNγ Biolegend 4S.B3 Mass: 165
PTEN BD A2B1 Mass: 159
TNFα Biolegend Mab11 Mass: 166
Note: If the manufacturer is stated as Fluidigm, this antibody was purchased from Fluidigm with metal pre-conjugated. If the manufacturer is stated as other than Fluidigm, this antibody was self-conjugated using the MaxPar Multi-Metal Labeling  Kit (Fluidigm Cat: 201300) according to manufacturer protocol. 

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण मुद्दा १३६ उन्मुक्ति साइटोकिंस सेल उपसमुच्चय परिधीय पूरे रक्त प्लाज्मा एंटीबॉडी मास cytometry चुहियों
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