Aqui nós descrevemos uma abordagem proteômica de célula única para avaliar imunológico fenotípico e funcional (indução de citocinas intracelulares) alterações nas amostras de sangue periférico, analisadas através de citometria de massa.
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Artigo de método
Análise de célula única do imunofenótipo e produção de citocinas no sangue periférico através de citometria de massa
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Citocinas desempenham um papel crucial na patogênese de doenças auto-imunes. Daí, a medição dos níveis de citocina tem sido o foco de vários estudos na tentativa de compreender os mecanismos precisos que levam ao colapso da auto-tolerância e auto-imunidade subsequente. Abordagens, até agora tem sido baseadas no estudo de um aspecto específico do sistema imunológico (um único ou alguns tipos de células ou citocinas) e não oferecer uma avaliação global da doença auto-imune complexa. Enquanto o pacientes estudos baseados em soros tem conseguido importantes insights sobre auto-imunidade, eles não fornecem a fonte celular específica a desregulação citocinas detectadas. Uma abordagem abrangente de célula única para avaliar a produção de citocinas em vários subconjuntos de células imunes, dentro do contexto de "intrínseco" plasma paciente específico, fatores, de circulação é descrita aqui. Esta abordagem permite a monitoração do paciente específico imune fenótipo (marcadores de superfície) e função (citocinas), quer na sua nativa "intrínseco patogénicos" doença estadual, ou na presença de agentes terapêuticos (em vivo ou ex vivo).
Introdução
As doenças auto-imunes são das principais causas de morbidade e mortalidade, afetando 3-8% da população. Nos Estados Unidos, desordens auto-imunes estão entre as principais causas de morte entre as mulheres jovens e de meia-idade (idades < 65 anos)1,2. Doenças auto-imunes são caracterizadas por apresentação clínica heterogênea e diversos processos imunológicos subjacentes. O espectro da heterogeneidade está bem representado através de diferentes transtornos, tais como a participação conjunta em artrite reumatoide (ar) e doença neurológica em esclerose múltipla (MS). No entanto, este nível de heterogeneidade ta....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por o Colorado múltiplos institucional Review Board (COMIRB) da Universidade do Colorado. Todos os procedimentos descritos abaixo devem ser executados em uma capa de cultura de tecidos estéreis, salvo indicação em contrário, com pontas de pipetas filtrada, e todos os reagentes filtrada.
1. preparação dos reagentes para o processamento de sangue periférico
- Prepare ruxolitinib estoque alíquotas (10 – 15 μL/frasco para uso individual) em 10mm diluindo o reagente liofilizado em DMSO, conforme as instruções do fabricante (loja a-80 ° C). Manter concentrações de DMSO em todos os ensaios, i....
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Resultados
A Figura 1 demonstra o fluxo de trabalho para a estimulação e processamento das amostras de sangue periférico, incluindo a alocação das alíquotas de amostra de sangue, sincronismo da adição de agentes de estimulação, proteína de transporte inibidor cocktail e incubação vezes até o lysis da pilha de sangue vermelha (RBC) e fixação. A escolha dos agentes estimulantes dependerá as vias de sinalização e citocinas que são direcionadas para a avaliação. Por exemplo.......
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Discussão
Aqui descrevemos um romance, unicelulares, abordagem proteômica para avaliar simultaneamente a vários tipos de células imunes e detectar suas várias citocinas perturbações no meio do paciente específico "" plasma de sangue periférico circulantes fatores patogênicos. Este método emprega o sangue periférico como o veículo analítico e citometria de massa como a ferramenta para a avaliação de anormalidades fenotípicas e funcionais de celulares imunes. O método é prontamente aplicável a estudos de humanos e ratos
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer o contributo intelectual e comentários úteis Aimee Pugh-Bernard. Este trabalho foi apoiado pelo Boettcher Fundação Webb-Waring Biomedical Research Award e prêmio número K23-1K23AR070897 do NIH para Elena W.Y. Hsieh. Ela também foi apoiada pelo prêmio número K12-HD000850 de Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano e a Lucile Packard Foundation para saúde infantil, Stanford CTSA UL1 TR001085 e pesquisa de saúde infantil Instituto da Stanford University.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ruxolitinibe | Santa Cruz | SC-364729A | Estoque Conc: 10 mM; Conc final: 5 μ M |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848-5 | Stock Conc: 1 μ g/μ L; Conc Final: 1 μ g/mL |
| LPS-EK | Invivogen | tlrl-eklps | Teor de Estoque: 1 μ g/μ L; Conc final: 0.1 μ g/mL |
| Estéril PBS | Lonza | 17-516F | |
| Lyse/Fix Buffer | BD biosciences | 558049 | Stock Conc: 5X; Conc Final: 1X (diluir em ddH2O) |
| BD Phosflow buffer de perm/lavagem I | BD biosciences | 557885 | Conc de Estoque: 10X; Conc final: 1:10 (diluído em ddH2O) |
| RPMI | Gibco | 21870-076 | |
| Azida de sódio (NaN3) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Conc de estoque: >99,9%; Conc Final: 0.0002 |
| Inibidor de Transporte de Proteína (PTI) | eBiosciences | 00-4980-93 | Conc de Estoque: 500X; Final Conc: 1X |
| DNA Intercalator | Fluidigm | 201192B | Stock Conc: 500 μ M; Conc final: 0.1 μ |
| Meios de coloração de células M (CSM) | PBS + 0,5% BSA, 0,02% NaN3 | ||
| MaxPar Barcode Perm | Buffer Fluidigm | 201057 | Stock Conc: 10X; Conc Final: 1X |
| Conjunto de Código de Barras Pd 20-plex | Fluidigm | S0014 | Conc de Estoque: n/a; Cálculo Final: n/a |
| EQ TM Quatro Elementos Calibração de Esferas | Fluidigm | 201078 | Cálculo de Estoque: 10X; Conc Final: 1X |
| Solução de Formaldeído Livre de MeOH a 16% | Thermo | 28908 | Conc de Estoque: 16% (p/v); Conc final: 1,6% (p/v) |
| Tubos de poliestireno de fundo redondo estéril | VWR | 60818-496 | Conc de stock: n/a; Conc Final: n/a |
| Tubos de cluster de polipropileno | Light Labs | A-9001 | Conc de estoque: n/a; Conc final: n/a |
| Helios Instrumento CyTOF | Fluidigm | Helios | Todas as soluções a serem usadas na análise CyTOF precisam estar livres de contaminação por metais. ddH2O é usado na preparação de qualquer solução deve ter uma resistividade de pelo menos 18,0 MΩ. cm. ddH2O e quaisquer soluções preparadas pelo próprio devem ser armazenadas em novos frascos de plástico ou vidro que nunca tenham sido autoclavados. |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Anticorpos usados para citometria de massa< | |||
| strong>Marcadores de superfície | |||
| CD1c | Biolegend | L161 | Massa: 161 |
| CD3 | BD | UCHT1 | Massa: 144 |
| CD4 | Biolegend | SK3 | Massa: 174 |
| CD7 | BD | M-T701 | Massa: 149 |
| CD8 | Biolegend | SK1 | Massa: 142 |
| CD11b | Fluidigm | ICRF44 | Massa: 209 |
| CD11c | BD | B-ly6 | Massa: 152 |
| CD15 | BD | HI98 | Massa: 115 |
| CD14 | Biolegend | M5E2 | Massa: 154 |
| CD16 | eBioscience/Thermo | B73.1 | Massa: 165 |
| CD19 | Santa Cruz | SJ25C1 | Massa: 163 |
| CD21 | Biolegend | Bu32 | Massa: 141 |
| CD27 | BD | L128 | Massa: 155 |
| CD38 | Fluidigm | HIT2 | Massa: 172 |
| CD45 total | Biolegend | HI30 | Massa: 89 |
| CD45RA | Biolegend | HI100 | Massa: 153 |
| CD56 | Miltenyi | REA196 | Massa: 168 |
| CD66 | BD | B1.1/CD66 | Massa: 113 |
| CD86 | Fluidigm | IT2.2 | Massa: 150 |
| CD123 | Fluidigm | 6H6 | Massa: 143 |
| CD278/ICOS | Biolegend | C398.4A | Massa: 156 |
| CD179/PD1 | Biolegend | EH12.2H7 | Massa: 162 |
| IgD | Biolegend | IA6-2 | Massa: 146 |
| IgM | Biolegend | MHM-88 | Massa: 151 |
| CXCR5 | BD | RF8B2 | Massa: 173 |
| HLADR | Biolegend | L243 | Massa: 167 |
| Citocinas | |||
| IL-1&alfa; | Biolegend | 364-3B3-14 | Massa: 147 |
| IL-1β | Biolenda | H1b-98 | Massa: 169 |
| IL-1RA | Santa Cruz | AS17 | Massa: 157 |
| IL-6 | Biolegend | MQ2-13A5 | Massa: 164 |
| IL-8 | BD | E8N1 | Massa: 160 |
| IL-12/IL-23p40 | Biolegend | C8.6 | Massa: 171 |
| IL-17A | Biolegend | BL168 | Massa: 148 |
| IL23p19 | eBioscience/Thermo | 23dcdp | Massa: 176 |
| MIP1β | BD | D21-1351 | Massa: 158 |
| MCP1 | BD | 5D3-F7 | Massa: 170 |
| IFNα | Miltenyi | LT27:295 | Massa: 175 |
| IFN&gama; | Biolegend | 4S. B3 | Massa: 165 |
| PTEN | BD | A2B1 | Massa: 159 |
| TNFα | Biolegend | Mab11 | Massa: 166 |
| Nota: Se o fabricante for declarado como Fluidigm, este anticorpo foi adquirido da Fluidigm com metal pré-conjugado. Se o fabricante for declarado como diferente do Fluidigm, este anticorpo foi autoconjugado usando a rotulagem MaxPar Multi-Metal Kit (Fluidigm Cat: 201300) de acordo com o protocolo do fabricante. |
Referências
- Walsh, S. J., Rau, L. M. Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States. American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).
- Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M.
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Reimpressões e permissões
