Summary
Dieser Bericht beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs. Die Methode verwendet, die synthetische biotinylierte gesperrt Nukleinsäure LNA-basierte MiRNA imitiert erfassen gezielt mRNA. Anschließend Streptavidin beschichteten magnetische Beads werden eingesetzt, um Pulldown das Ziel mRNA zur Quantifizierung von qPCR-Polymerase-Kettenreaktion.
Abstract
Micro-RNAs (MiRNAs) sind eine Klasse von kleinen Forensisches RNAs, die post-transcriptionally zellulären Genexpression regulieren. MiRNAs binden an die 3' untranslatierten Region (UTR) target mRNA zu Protein Übersetzung hemmen oder in einigen Fällen verursachen mRNA Abbau. Die Bindung von MiRNA, die 3' UTR des Ziels, die mRNA durch eine 2 – 8 Samen Nukleotidsequenz am 5'-Ende der MiRNA vermittelt wird. Während die Rolle von MiRNAs als zelluläre Regulatorische Moleküle gut etabliert ist, bleibt Identifikation von der Ziel-mRNAs mit funktionelle Relevanz eine Herausforderung. Bioinformatic Hilfsmittel sind eingesetzt worden, Sequenzen innerhalb der 3' UTR von mRNAs als potentielle Ziele für MiRNA Bindung vorherzusagen. Diese Werkzeuge wurden auch genutzt, um die evolutionäre Erhaltung solcher Sequenzen unter verwandten Arten in einem Versuch, die funktionelle Rolle Vorhersagen zu bestimmen. Aber diese Berechnungsmethoden oft falsch-positive Ergebnisse zu generieren und beschränken sich auf die Vorhersage kanonische Zusammenspiel von MiRNA und mRNA. Experimentelle Verfahren, die direkte Bindung von MiRNA mRNA Ziel Messen sind daher notwendig, um funktionelle Interaktion herzustellen. In diesem Bericht beschreiben wir eine empfindliche Methode für die direkte Interaktion zwischen der zellulären MiRNA-MiR-125b und der 3' UTR von PARP-1 mRNA Validierung. Wir erarbeiten ein Protokoll, in dem synthetischen biotinylierte-MiRNA imitiert wurden in Säugerzellen transfiziert und der MiRNA-mRNA-Komplex in die zelluläre lysate wurde mit magnetischen Beads Streptavidin beschichteten abgerissen. Schließlich das Ziel, die, das mRNA in das nach unten gezogen-Nukleinsäure komplexe quantifiziert wurde mit einem qPCR-basierte Strategie.
Introduction
Micro-RNAs (MiRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs, die Protein-Expression-1negativ regulieren. Vorläufer der MiRNA befinden sich im Cluster durch viele Regionen des Genoms, am häufigsten in den intergenetischer Regionen und Introns der Protein-kodierenden Gene2,3. Biogenese von MiRNAs beinhalten Transkription von Pri-MiRNAs von MiRNA-Kodierung Gene4. Die Pri-MiRNAs unterziehen sequenzielle Verarbeitung, zuerst in den Zellkern und dann im Zytoplasma, einzelne gestrandeten Reife MiRNAs4,5zu generieren. Anschließend die Reife MiRNAs fließen in den RNA-induced silencing-Komplex (RISC): ein Multimeric Protein-RNA-Komplex, der ein Mitglied der Argonaut-Familie von Proteinen für Ziel Anerkennung4,5, enthält 6,7. Reife MiRNAs in komplexen RISC überwiegend binden an die 3' UTR Ziel mRNAs8,9,10 aber können auch gelegentlich in der Kodierung und der 5' UTR Region der mRNA10,11 binden . Die Bindung von MiRNA, die mRNA-Sequenzen Ergebnisse in translational stummschaltungs-12,13,14 und in einigen Fällen mRNA Destabilisierung15. Da ein einzelnes MiRNA viele mRNAs ausrichten kann, diese Regulatorische Moleküle sind fast alle zellulären Prozess beteiligt und haben in verschiedenen Krankheit Bedingungen16,17,18in Verbindung gebracht.
Detailliertes Verständnis der wie MiRNAs zelluläre Signalwege regulieren erfordert Identifizierung des Ziels mRNAs. Mehrere Bioinformatik-Plattformen zur Verfügung, vermeintliche MiRNA:mRNA Interaktionen19,20vorherzusagen. Diese Vorhersagen verlassen sich auf perfekte Watson-Crick-Basenpaarung zwischen den 2 – 8 Samen Nukleotidsequenz von der MiRNA und einer komplementären Sequenz innerhalb der Ziel-mRNA-4,-21. Darüber hinaus diese Tools generieren Sekundärstruktur des MiRNA:mRNA Duplex, thermodynamischen Parameter dieser molekularen Wechselwirkung berechnen und zeigen Erhaltung der die Bindungsstellen über Artgrenzen, funktionelle Relevanz des Ziels zu verbessern Vorhersage. Leider haben diese Tools auch die Begrenzung der Vorhersage falsch positive Ziele um eine sehr hohe Rate (~ 27 – 70 %)15,22. Am wichtigsten ist, nicht diese in Silico -Plattformen, der nicht-kanonischen Wechselwirkungen von MiRNAs mit ihrer Ziele23zu erkennen. Daher sind solche vorausschauenden Analysen oft mit experimentellen Methoden, um funktionell relevante Ziele validieren kombiniert.
Mehrere Ansätze wurden entwickelt, um MiRNA:mRNA Wechselwirkung experimentell zu überprüfen. Genetische Experimente mit MiRNA Mimik, Aufschlüsse Schwämme und Inhibitoren, die die Ebenen von MiRNAs in der Zelle ändern für seine regulierende Wirkung auf die Ziel-Gen Ausdruck24,25,26. Darüber hinaus Reporter basierte Assays über Co-Transfektion eines Klons mit der 3' UTR-Region von der Ziel-mRNA und MiRNA-Fließbildern oder Inhibitoren in Zellen liefern Hinweise auf die regulatorische Funktion der MiRNAs26. Während diese Methoden entscheidend für posttranskriptionelle Regulation der Genexpression von MiRNAs studieren, sind Transfektion Effizienz und Pleotropic Effekte von Veränderungen in der zellulären MiRNA Ebenen wesentliche Einschränkungen diese gentechnische Ansätze23, 26. Daher werden ergänzende biochemische Methoden, die direkte Interaktion zwischen MiRNA und seinem Ziel Sonde eingesetzt, um besser zu verstehen, die zelluläre Funktion der MiRNAs.
Eine weit verbreitete Methode, direkte Interaktion zwischen MiRNA und seinem Ziel zu studieren ist Immunopräzipitation der RISC Komplex, gefolgt von den Nachweis von mRNA Ziel innerhalb der komplexen27,28,29,30 . Vor kurzem wurde auch eine verbesserte RISC-Trap-Methode eingesetzt, um MiRNA Ziele zu identifizieren; Stabilisierung der Ziele innerhalb der RISC-MiRNA-mRNA Zwischenprodukte Paare es mit der Reinigung der mRNA-Ziele. Aber diese Methodsface die inhärenten Herausforderungen der unspezifische Wechselwirkungen zwischen RNA und RNA-bindende Proteine, die in der Regel von zellulären Kompartimenten31,32getrennt werden. Darüber hinaus sind diese Tests auf das Vorhandensein von Protein AGO2 für Immunopräzipitation RISC Komplex33angewiesen. Angesichts der Tatsache, dass AGO2 nicht die einzige Argonaut ist, effiziente MiRNA:mRNA Interaktionen vermitteln, führen verzerrte Ergebnisse34Ausschluss von anderen Argonautes. Deshalb sind alternative Strategien erforderlich, um direkte Bindung von MiRNA zu mRNA zu studieren.
In diesem Bericht erarbeiten wir einen einstufigen Ansatz zum Sondieren direkte Interaktion zwischen einem MiRNA und seinem Ziel mRNA. Erstens sind 3' biotinylierte gesperrt Nukleinsäure (LNA) MiRNA Mimik in Säugerzellen transfiziert. Dann ist der MiRNA:mRNA Komplex in die zelluläre lysate mit Streptavidin beschichteten magnetische Beads erfasst. Die mRNA-Ziel verpflichtet, seine ergänzenden MiRNA wird quantifiziert mit qPCR.
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Protocol
1. die Transfektion von 3' biotinylierte miRNA
Hinweis: Führen Sie folgende Schritte in eine sterile Laminar-Flow-Kapuze.
- 4 x 105– 5 x 105 HEK 293T Samenzellen pro Bohrloch in 2 mL komplett Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) [DMEM mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 1 x Stift-Strep Antibiotikum ergänzt]. Kultur der Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2 über Nacht eingestellt.
- Am nächsten Tag, überprüfen Sie die Gesundheit und die Einhaltung der vergoldeten Zellen unter einem Lichtmikroskop.
Hinweis: Stellen Sie sicher die Zellen haben eingehalten und erreicht entsprechende Morphologie, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Die HEK-293T-Zellen sind in der Regel bereit zur Transfektion 18 – 24 h post-Beschichtung. - Verdünnen Sie in einem sterilen 1,7 mL Microfuge Rohr 75 Picomoles der biotinylierte MiRNA in 200 µL der minimalen wesentlichen Medien. Übertragen Sie diese Mischung auf eine weitere 1,7 mL Microfuge Rohr enthaltenden Liposomen basierend Transfektion Reagenz (8 µL/Well) verdünnt in 200 µL der minimalen wesentlichen Medien. Mischen Sie gründlich, aber sanft, durch pipettieren und inkubieren Sie für 20-25 min bei Raumtemperatur zur Bildung der Transfektion komplexe ermöglichen.
- Entfernen Sie die alten Medien aus der Platte 6 gut Kultur durch sanfte pipettieren und ergänzen Sie jedes gut mit 1,6 mL frisch zubereitete komplette DMEM (ohne 1 x Stift-Strep Antibiotika).
- Fügen Sie die Transfektion komplexe (ab 1.3) tropfenweise auf die Zellen in der 6-Well-Platte mit einer gut kalibrierten Pipette. Schwenken Sie die Platte vorsichtig beim Hinzufügen der komplexe um ihre gleichmäßige Verteilung über die Platte zu gewährleisten.
Hinweis: Dieser Schritt ist sehr wichtig für die Erreichung Hocheffizienz Transfektion und muss mit Sorgfalt und Geduld durchgeführt werden. - Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2 für mindestens 36 Stunden.
2. Vorbereitung des Streptavidin beschichteten magnetische Beads – ich
- Die Streptavidin magnetische Beads gründlich durch Vortexen aufzuwirbeln. Übertragen Sie 30 µL Wulst Suspension (je Probe) auf ein 2 mL Nuklease-freie Microfuge Rohr.
- Legen Sie das Rohr mit der Perle Federung auf die magnetische Wulst Trennzeichen stehen (im folgenden "Magnet") für 2 min. Entfernen Sie nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Perlen auf die Seite des Rohres in Kontakt mit den Magneten gezogen sind vorsichtig den Überstand mit einer Mikropipette.
- Die Perlen 100 µL Waschpuffer Perlen (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) hinzufügen. Entfernen Sie den Schlauch vom Magneten. Wirbel für 15 s bei Raumtemperatur, die Perlen zu waschen.
- Legen Sie die Röhrchen mit Perlen auf den Magneten für 2 min und sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 für eine Gesamtmenge von drei Wäschen. Entfernen Sie nach dem letzten Waschschritt das Rohr vom Magneten.
- 100 µL RNase-Lösung (0,1 M NaOH, 0,05 M NaCl) zu befreien, um die Perlen hinzufügen, mischen Sie gut durch Vortexen für 15 s, und bei Raumtemperatur inkubieren, für 5 min. statt der Röhrchen mit Perlen auf den Magneten für 2 min und sorgfältig entfernen und entsorgen den überstand.
- Wiederholen Sie Schritt 2.6 für insgesamt drei Mal.
- Die Perlen, Wirbel 15 s Perle Wiederfreisetzung Lösung (0,5 M NaCl) hinzu und bei Raumtemperatur inkubieren Sie, 5 min. die resuspendierte Perlen auf den Magneten für 2 min, und entfernen Sie vorsichtig den überstand.
- Die Perlen fügen Sie 200 µL der Wulst blockiert Lösung (1 µg/µL BSA, 2 µg/µL Hefe tRNA hinzu). Mix von sanften Vortexen für 15 s bei Raumtemperatur. Bei 4 ° C für 16 Stunden (über Nacht) auf ein Multi-Tube Rotator inkubieren.
3. Vorbereitung der Zelle Lysates
- Ernte die transfizierten Zellen HEK-293T durch sanfte Kratzen mit einem sterilen Zelle Schaber in der laminaren Kapuze, dann jede Probe in ein steril 2 mL Microfuge Rohr übertragen.
- Pellet-geschabten Zellen durch Zentrifugation bei 1.500 X g für 5 min. Aufschwemmen das Pellet in 1 x sterile PBS (Phosphat-Puffer Kochsalzlösung), pH 7,2. Zentrifuge wieder bei 1.500 X g für 5 min um ein Pellet verbleibende Medien kostenlos zu erhalten. Sofort stürzen die Röhrchen mit Pellet in Eis.
- Bereiten Sie komplette Frischzellen Lyse Puffer (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH 7.5, 5mM DTT, 0,5 % IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 x Protease-Hemmer).
Hinweis: Eine Aktie der Zelle Lysis Puffer fehlt IGEPAL, Superase und Protease-Inhibitor-Cocktail kann im Voraus vorbereitet und bei Raumtemperatur gelagert. Bereiten Sie eine neue Charge von kompletten Zelle Lysis Puffer, indem die oben genannten Ergänzungen bei den empfohlenen Endkonzentrationen auf Lager Zelle Lysis Puffer und Speicherung auf Eis. - Jede Probe in der Microfuge Röhre (d. h. jedes Microfuge Rohr Zellen aus einem Brunnen des 6-Well-Platte enthält) 260 µL eiskalte vollständige Zelle Lysis Puffer hinzu und Aufschwemmen der Zelle Pellet in eine homogene Suspension durch pipettieren.
- Lösen Sie die Zellen mit der Frost-Tau-Methode: die Rohre bei-80 ° C für 10 – 15 min inkubieren. Führen Sie die Zellen, die auf dem Eis Auftauen.
- Zentrifugieren Sie die daraus resultierenden Zelle lysate 16.000 x g für 5 min in einer gekühlten Benchtop-Zentrifuge bei 4 ° c eingestellt
- Übertragen Sie die gelöschte Zelle lysate zu einem sterilen 1,7 mL Microfuge Schlauch auf Eis. Entsorgen Sie das Pellet.
Anmerkung: Der letzte Band der gelöscht lysate sollte ~ 240 – 250 µL. - Eine Endkonzentration von 1M 5 M NaCl auf den geräumten lysate hinzu und pflegen Sie die Proben auf Eis.
4. Vorbereitung der magnetischen Beads Streptavidin-II
- Bereiten Sie frische komplette Pulldown-Waschpuffer (10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DVB-t, 1 M NaCl, 0,5 % IGEPAL, 60U/mL Superase und 1 X Proteaseinhibitor Cocktail)
Hinweis: Ein Bestand von Pulldown-Waschpuffer fehlt IGEPAL, Superase und Protease-Inhibitor-Cocktail kann im Voraus vorbereitet und bei Raumtemperatur gelagert. Bereiten Sie eine neue Charge von kompletten Zelle Lysis Puffer, indem die oben genannten Ergänzungen bei den empfohlenen Endkonzentrationen auf Lager Zelle Lysis Puffer und Speicherung auf Eis. - Legen Sie das Rohr mit das der vorbereiteten Perlen (aus Schritt 2,9) auf den Magneten für 2 min. vorsichtig entfernen und entsorgen den überstand.
- Die Perlen 150 µL des eiskalten komplette Pulldown-Waschpuffer hinzufügen. Wirbel für 15 s und 30-60 S. Ort die Rohre auf den Magneten für 2 min. vorsichtig entfernen und entsorgen den Überstand bei Raumtemperatur inkubieren.
- Wiederholen Sie Schritt 4.3 für insgesamt 3 Mal.
- Die Perlen in 300 µL kompletten Pulldown-Waschpuffer aufzuwirbeln.
(5) Pull-Down der Ziel-mRNA-MiRNA-komplexe
- 300 µL der Zelle lysate (aus Schritt 3,8) übertragen, die Microfuge Röhrchen mit 300 µL Perlen (aus Schritt 4.5).
- Inkubieren Sie die Mischung auf einem Nutating Mixer für 1 h bei Raumtemperatur.
- Legen Sie das Rohr auf den Magneten, denn 5 min. vorsichtig entfernen und entsorgen den überstand.
- Die Perlen 300 µL der eiskalte komplette Pulldown-Waschpuffer hinzufügen. Wirbel für 15 s bei Raumtemperatur und Ort das Rohr auf den Magneten für 5 min. vorsichtig entfernen und entsorgen den überstand.
- Wiederholen Sie Schritt 5.4 zwei weitere Male.
- Aufschwemmen Sie die Perlen in 100 µL Nuklease-freies Wasser und inkubieren Sie auf Eis.
6. total RNA-Extraktion, cDNA Synthese und qPCR
- Die resuspendierte Perlen (aus Schritt 5.6) total RNA extrahieren mit einer geeigneten Methode (siehe Tabelle der Materialien). Die extrahierte gesamte-RNS in 25 µL Nuklease-freies Wasser aufschwemmen. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und Qualität mit einem Spektralphotometer (Extinktion bei 260/280). Bereiten Sie eine arbeiten-Aktie von RNS zu 50 ng/µL.
- Führen Sie cDNA Synthese, in Triplicates, mit 50 ng von Gesamt-RNS (aus Schritt 6.1) mit einer entsprechenden cDNA Synthese kit (siehe Tabelle der Materialien) mit Oligo-dT-Primer in einem Endvolumen von 20 µL (Tabelle 1). Dann Last PCR Schläuche in das qPCR Instrument Temperaturzyklen gemäß den in Tabelle 2beschriebenen Bedingungen durchführen.
-
Führen Sie qPCR auf die CDNA (aus Schritt 6.2) mit SYBR Green Chemistry (siehe Tabelle der Materialien):
- Führen Sie alle qPCR Reaktionen im Triplicates in eine 96 gut klar Bodenplatte unter sterilen Bedingungen.
- Aliquoten 9 µL des Reaktionsgemisches vom qPCR Master in jede Vertiefung der Platte mischen (siehe Tabelle 3). Dann fügen Sie 1 µL cDNA in jede Vertiefung zu einem Endvolumen von 10 µL. Dichtplatte die PCR mit hitzebeständigen PCR Platte Sealer und laden Sie in das qPCR-instrument
- Durchführen Sie Temperaturzyklen gemäß den in Tabelle 4beschriebenen Bedingungen.
- Der Ausdruck Ebenen (Ct-Werte) der Samples, die Ausdruck Steuerungsebenen die verschlüsselte zu normalisieren. Verwenden Sie diese Werte, um Falten Änderungen im Ausdruck berechnen.
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Representative Results
MiRNAs regulieren zelluläre Prozesse durch die Bindung an Ziel mRNAs. Daher sind identifizierende mRNA Ziele eine wichtige, MiRNA Funktion zu verstehen. Hier erarbeiten wir eine Methode zur Identifizierung von mRNA Ziel der zellulären MiRNA. Dieses Protokoll wird von Wani Et al. 35 mit der Änderung der Nutzung biotinylierte LNA-basierte MiRNA Mimik, Pulldown Ziel mRNA. Die Verwendung von LNA-basierte Oligonukleotid Fließbildern verbessert Spezifität Ziel Bindung aufgrund der höheren Stabilität des modifizierten Ribose Rings ohne toxische Wirkungen36,37,38. Wir Beschäftigten zum pull-down-PARP-1 mRNA als Ziel des zellulären MiRNA MiR-125b dieser Methode. MiR-125b Ausdruck auf höchste Niveau ist im Hirngewebe erkannt, der neuronalen Funktion39,40regelt. In einem Versuch, die Ziele von MiR-125b in neuronalen Zellen zu identifizieren vor kurzem berichteten wir, dass diese MiR 125b negativ PARP-1 Ausdruck durch die Bindung an die 3' UTR von PARP-1 mRNA41regelt.
Pulldown von MiRNA:mRNA Komplex
Wir verwendet HEK-293T Zellen, um die Interaktion zwischen MiR-125b und PARP-1 mRNA zu studieren, da diese Zellen in zellulären, biochemischen und molekularbiologischen Untersuchungen weit verbreitet sind. Eine schematische Darstellung des für die mRNA-Ziel verwendete Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt. HEK-293T Zellen (4 x 105– 5 x 105 pro Well) wurden zunächst über Nacht in einer Gewebekultur 6-Well-Platte und inkubierten bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 18 – 24 h ausgesät. Danach wurden 75 Picomoles von 3' biotinylierte MiR 125b Mimik und 3'-biotinylierte Rührei Kontrollen in die Zellen, die mit Liposomen basierte Transfektion Methode transfiziert. Transfizierte Zellen wurden bei 37 ° C und 5 % CO2 für weitere 36 h inkubiert und geerntet. Danach zelluläre Lysates von transfizierten Zellen wurden durch die Gefrier-tau-Lyse-Methode vorbereitet. Die frisch zubereiteten zellulären Lysates wurden mit den blockierten Streptavidin beschichteten magnetischen Kügelchen auf einer Bank Top Nutating Mixer für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss daran die Perlen wurden verarbeitet und frisch gewaschen mit eiskalten Pulldown-Waschpuffer auf den Magnetabscheider vorbereitet. Zu guter Letzt wurden die Perlen in 100 µL Nuklease freies Wasser zur weiteren Analyse Nukleinsäuretablette.
Erkennung der Ziel-mRNA in der Pulldown-MiRNA:mRNA Komplex
Um das Ziel zu erkennen mRNA von MiR-125b aus der Pulldown-Mischung, wir Beschäftigten einen qPCR-Assay (Abbildung 1). Wir entwarfen forward und reverse Primer (FP und RP) innerhalb der ORF PARP-1 mRNA (Abbildung 2Tabelle 5 b) zu verstärken. Wir auch Primer Bühnenbilder für die Erkennung von p53 mRNA, ein bekanntes Ziel von MiR 125b42, als Positivkontrolle entworfen und Primer Aktin verstärken mRNA als unspezifische Negativkontrolle. Darüber hinaus haben wir zur weiteren Bestätigung der Spezifität der Verstärkung, Primer für die Erkennung der 3' UTR Regionen von PARP-1, p53 und Aktin entwickelt. Wir führten qPCR in das Protokoll (siehe Abschnitt 6) beschriebenen Methoden verwenden.
Abbildung 3 zeigt die qPCR basierte Verstärkung der Ziel-mRNA im Vergleich zu Rührei Steuerelemente aus der gereinigten Perlen ist. Das Niveau von PARP-1 mRNA war deutlich höher in Proben gezogen-Down mit biotinylierte MiR 125b ahmt die verschlüsselten Kontrollen gegenüber. Wie erwartet, Steuern höher mRNA-Niveaus des Positivs p53 mRNA und minimale Verstärkung von der Negativkontrolle Actin mRNA in diesen Proben beobachtet wurde. Vergleichbarem Verstärkung erhielten unter Verwendung der Zündkapseln gezielt die 3' UTR von PARP-1 und p53 im Vergleich zu der Negativkontrolle Aktin (Abb. 3 b). Die qPCR ergibt sich der ORF Regionen (Abbildung 3A) und der 3' UTR Regionen (Abb. 3 b) von PARP-1 mRNA und p53 mRNA zeigte einige Niveaus der Variabilität. Mehrere Faktoren wie Bindungsaffinität, Anzahl der MiRNA-Bindungsstellen und Unterschiede in der Grundierung-Sequenz, die abhängige Verstärkung zu den Variablen Verstärkung in Abbildung 3beitragen kann. Dennoch unterstütze diese Daten die Machbarkeit und Spezifität der Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokolls für das Ziel erfassen Assay mit biotinylierte MiRNA Mimik. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: besser gekleideteres Design für Verstärkung der mRNA Ziele. Schematische Darstellung der Primer verwendet, um das Ziel zu erkennen mRNA von MiR 125b. Ein Satz von Primern (machte ich mich) wurde innerhalb der ORF-Region von Abschriften und andererseits Set der Zündkapseln (Set II) wurde in der 3' UTR Region der Zielgene entwickelt. FP und RP stehen für forward und reverse Primer für jeden Satz. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: MiR-125b-Target-Identifizierung von qPCR. (A) mRNA-Niveaus mit Grundierung Ziel I, die die ORF Region verstärkt mRNA. Höheren Ausdruck von PARP-1 und p53 mRNA (Positivkontrolle) beobachtet wurden, im Vergleich zu Actin mRNA (Negativkontrolle). (B) Verstärkung der 3' UTR Region Ziel eingestellt mRNA mit Primer II. Keine Verstärkung verzeichneten keine Vorlagensteuerelemente (NTC). Alle Reaktionen wurden in Triplicates durchgeführt und die Daten wurden analysiert mit Hilfe der entsprechenden Software zur Datenanalyse basierend auf der 2-ΔCt -Methode. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Komponente | Lager | Endvolumen für 20 μL Reaktion |
| Vorlage (RNA) | 50 ng/µL | 1,0 ΜL |
| Reaktion-Puffer | 5 x | 4.0 ΜL |
| Oligo-dT-Grundierung | Master-Lager | 2 ΜL |
| Reverse Transkriptase | Master-Lager | 1 ΜL |
| Nuklease-freies destilliertes Wasser | - | 12 ΜL |
| Gesamte Reaktionsvolumen | 20 ΜL |
Tabelle 1: cDNA Synthese Reaktionsgemisch.
| 105 ° C = 30 s |
| 42 ° C = 60 min |
| 95 ° C = 5 min. |
| 10 ° C = Hold |
Tabelle 2: cDNA Synthese Radsport Thermik.
| Komponente | Lager | Endvolumen für 10 μL Reaktion |
| cDNA-Produkt | - | 1,0 ΜL |
| iTaq Universal SYBR Mischung | 2 x | 5,0 ΜL |
| Ziel (ORF/3 ' UTR) f.p. | 10 ΜM | 0,5 ΜL |
| Ziel (ORF/3 ' UTR) R.P. | 10 ΜM | 0,5 ΜL |
| Nuklease-freies destilliertes Wasser | - | 3 ΜL |
| Gesamte Reaktionsvolumen | 10 ΜL |
Tabelle 3: qPCR Reaktionsgemisch.
| 95 ° C = 10 min. |
| 30 Zyklen: |
| 95 ° C = 10 s |
| 56 ° C = 30 s |
| 72 ° C = 30 s |
| Kurvenanalyse schmelzen |
| 65 ° C = 31 s |
| Lineare Rampe Rate = 0,5 ° C/s |
| Erwerb = 0,5 ° C Intervalle |
Tabelle 4: qPCR Radsport Thermik.
| (A): Biotinylierte Oligos | ||
| Biotinlyated Oligos | Lager | Sequenz (5' 3') |
| hat MiR 125b | 25 ΜM | UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA-Biotin |
| Verschlüsselte Kontrolle | 25 ΜM | GAUGGCAUUCGAUCAGUUCUA-Biotin |
| (B) Primer | ||
| Ziel-Primer (ORF) | Lager | Sequenz (5' 3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | GAGGTGGATGGGTTCTCTGA |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | ACACCCCTTGCACGTACTTC |
| p53 (FP) | 100 ΜM | TGTGACTTGCACGTACTCCC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | ACCATCGCTATCTGAGCAGC |
| AKTIN (FP) | 100 ΜM | GCTCGTCGTCGACAACGGCTC |
| AKTIN (RP) | 100 ΜM | CAAACATGATCTGGGTCATCTT |
| (C) Primer | ||
| Ziel-Primer (3' UTR) | Lager | Sequenz (5' 3') |
| PARP-1 (FP) | 100 ΜM | ATTGGGAGAGGTAGCCGAGT |
| PARP-1 (RP) | 100 ΜM | CTACCCATCAGCAACTTAGCG |
| p53 (FP) | 100 ΜM | GGCCCATATCTGTGAAATGC |
| p53 (RP) | 100 ΜM | CTGCAGGAAGGCAGGTTTT |
Tabelle 5: Oligonukleotid-Namen und -Sequenzen.
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Discussion
Identifizierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs ist wichtig für das Verständnis ihrer regulatorischen Funktion. Mehreren Berechnungswerkzeuge werden eingesetzt, um Ziele auf der Grundlage Samen Reihenfolge Komplementarität und die Erhaltung der Ziel-Sequenzen19,20vorherzusagen. Obwohl diese Tools wertvoll sind, können sie hohe falsch positive und falsch negative generieren. Daher sind diese Vorhersagen gekoppelt mit experimentellen Methoden wie Immunopräzipitation RISC komplex und Pull-Down von MiRNA:mRNA Komplex, direkte Bindung von MiRNAs, ihre jeweiligen Ziele27,31zu bestätigen. Dieser Berichtdetails, die eine experimentelle Strategie für die biotinylierte MiRNA nutzt, Pulldown imitiert Ziel mRNA. Biotin-Pulldown kann zur Identifizierung von MiRNA Ziele mit hoher Empfindlichkeit und niedrige false-positive-Rate35,43verwendet werden. Diese Methode kann daher auch zur Identifizierung von MiRNA Ziele durch die Kopplung von Sequenz-basierte Screening erfassten RNA-Pool genutzt werden. Es gibt jedoch einige Einschränkungen auf diese Methode44. Überexpression von einem exogenen MiRNA könnten die transkriptionelle Netzwerk von Zellen, was daraus folgenden Veränderungen in mRNA, die nicht durch die MiRNA Regulierung ändern. Diese konnten überwunden werden, mithilfe von sehr geringe Mengen an Mimik um nicht endogene MiRNA Verordnung durcheinanderbringen. Auch sind geeignete Kontrollen erforderlich, wenn MiRNAs exogen ausgedrückt werden, um unspezifische Schwergängigkeit zu vermeiden. Vorsichtig waschen und blockieren Schritte können effektiv minimiert Hintergrundgeräusche und Spezifität der gezielten MiRNA zu erhöhen. Einige Studien haben gezeigt, dass Änderungen der MiRNA-3' und 5'-Enden sind nicht gut verträglich45, jedoch mehrere Studien haben effizient genutzt, Biotin markiert MiR-Mimik als ein wirksames Instrument um mRNA Ziele zu erkunden.
Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die Nutzung der LNA-basierte (verschlossene Nukleinsäure) MiRNA imitiert. Die LNA Nukleinsäure-Änderung ermöglicht die Bildung von stabilen Oligonukleotide Maisonetten mit hoher Affinität46,47. Darüber hinaus bestehen die benutzerdefinierte gemacht biotinylierte LNA MiRNA Mimik aus drei RNA-Stücke. Ein 3' biotinylierte MiRNA Strang mit Sequenz wie pro die MiRBase Anmerkung und ein Passagier Strang komplementär zu der MiRNA, die in zwei LNA-modifizierte RNA Stränge47aufgeteilt ist. RISC beinhaltet nur die MiRNA-Strang während der zwei Passagiere, die Stränge sind schneller abgebaut, wodurch es Ziel-Spezifität. Um das Vertrauen der Rechercheergebnisse zu erhöhen, haben wir ebenfalls eine validierte Ziel p53 von MiR 125b als positive Kontrolle und β-Aktin, die nicht über eine MiR-125b-Bindungsstelle in der mRNA als Negativkontrolle. Die Ergebnisse mit dieser Methode mit diesen Steuerelementen (Abbildung 3) zeigen Spezifität der mRNA zielkennzeichnung. Obwohl LNA MiRNA Mimik stabilisieren und stark begünstigen Watson-Crick-Basenpaarung, es hinzuweisen, dass die Verwendung von LNA MiRNA Mimik mit Biotin-Label lässt weder falsch positive als auch negative. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, dass sie Bestätigung der rechnerische Prognosen führen können, die nicht biologisch relevant sein könnten. Auf der anderen Seite, wenn diese Methode mit der Sequenzplanung mRNA Ziele identifizieren gekoppelt ist, können falsche Negative generiert werden, da LNA gefallen imitiert kanonische Basis Paarung, die nicht-kanonische Basis Paarung Interaktionen, die mit einheimischen MiRNAs auftreten ausschließen kann.
Das Protokoll hier vorgestellten ist von Wani Et Al, mit einigen Modifikationen35angepasst. Um weitere Hintergrundgeräusche zu reduzieren, haben wir umfangreiche Waschschritte aufgenommen, modifiziert die Parameter für die Transfektion Effizienz, Puffer Vorbereitung Inkubation, Pulldown und PCR-Datenerfassung und Analyse. Darüber hinaus wir zweierlei Grundierung verwendet, um das Ziel zu verstärken mRNA nach dem Pulldown-set entwickelt, um eine Region des ORF von verstärken gezielt mRNA und das zweite Set der Zündkapseln, um eine Region innerhalb der 3' UTR des Ziels zu verstärken mRNA. Nutzung von zwei Sätzen von Primer verbessert die Spezifität für die Ziel-mRNA-Anreicherung.
Es sei darauf hingewiesen, dass eine Einschränkung dieser Methode eine basale Lärm ist, die aus nicht-spezifische Ziele entsteht. Weitere Modifikationen wie Verbesserungen in der Sperrung, können höhere Ziel-Spezifität und Sensitivität Wasch- und Inkubation Bedingungen vorsehen. Zusammenfassend lässt sich sagen ist der Test in diesem Bericht beschriebenen eine schnelle und zuverlässige Methode, die angenommen werden kann, um mRNA Ziele von MiRNAs mittels einer PCR validieren Strategie.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine finanzielle und nicht finanzielle Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch die National Institutes of Health (NIH) Zuschüsse DA037779 (zu J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 und MD007586 (auf CD). Auch die RCMI Grant G12MD007586, Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, unterstützen die Arbeit war das Meharry translationale Research Center (MeTRC) CTSA gewähren (U54 RR026140 von NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 aus NIMHD/NIH und der Tennessee-Center for AIDS Forschung (P30 AI110527).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
References
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